Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu
Summary
Burada göbek kordon kanı habercisi alt B-hücreleri izole etmek için bir protokol açıklar. Nükleik asitlerin yeterli bir miktarı ve kalitesi hücrelerinden çıkarılır ve DNA ya da RNA kullanılarak daha sonraki deneylerde kullanılabilir.
Abstract
Göbek kordon kanı çok farklı soy bağlılığı aşamalarında hematopoetik progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir. Biz B-hücrelerinin farklılaşma dört farklı aşamalarında öncüsü izole etmek için bir protokol geliştirmiştir. Genlerin ifade ve epigenetik değişiklikler bir doku belirli bir şekilde meydana Çünkü, bu genomu ve hastalığın gelişmesine yol açabilir epigenom değişiklikler tespit edebilmek amacıyla doku ve hücre tipleri arasında ayrım önemlidir. Bu yöntem, ayırt herhangi bir aşamasında, göbek kordonu kanı hücre içinde mevcut herhangi bir tür için adapte edilebilir.
Bu yöntem, 4 temel aşamalarını kapsamaktadır. İlk olarak, mononükleer hücreler yoğunluk santrifüj ile ayrılır. İkinci olarak, B-hücreleri mononükleer hücrelerden non-B-hücreleri tanımak ve çıkarmak biyotin konjuge antikor kullanılarak zenginleştirilmiştir. Üçüncü olarak, B-hücrelerinin fluoresan ayrı aşamalara spesifik hücre yüzeyi proteini antikorları ile etiketlenmiştirB hücre gelişimi. Son olarak, floresan işaretli hücrelerin sıralanır ve bireysel nüfus geri kazanılır. Geri kazanılan hücreler aşağı nükleik asit tahlillerde kullanılmak için yeterli miktar ve kalitede.
Introduction
Hastalık mevcut olan sapmaları tespit etmek amacıyla, sağlıklı dokuların ya da hastalıktan etkilenen doku ya da hücre tipine karşılık gelen hücreleri kullanılan son derece önemlidir. Bunun bir nedeni, doku tipleri arasındaki epigenetik varyasyon gen ekspresyonu düzenleyen sorumludur ve normal insan gelişiminin 1,2 sırasında hücresel farklılaşma için kritik olmasıdır. İkinci nedeni aberran doku spesifik gen regülasyonu normal gelişim korkunç sonuçlara neden olabilir ve kanser gibi hastalık durumları çok sayıda katkıda bilinir. Bu nedenle, hematopoietik hücreler içeren bir hastalık daha iyi anlaşılması sağlıklı hematopoietik hücrelerin bilinmesini gerektirir.
Hücre yüzeyi ekspresyonu değişiklikleri ile karakterize edilen olayların sistematik bir düzen vasıtasıyla kemik iliği hematopoetik gelir hücrelerin gelişimi 3 markers. Yetişkin katılımcılar ile ilgili çalışmalar varPediatrik katılımcılar içeren çalışmalar prekürsör B-hücrelerinin yüzdesinin az 5 yaş 6 bireyler nispeten yüksek olduğunu göstermiştir iken; kemik iliği genellikle B-hücrelerinin 4,5 habercisi olarak düşük sayıda içerdiğini göstermiştir. Umbilikal kordon kanı, kan ile ilgili bozukluklar ve maligniteler tedavisinde hematopoietik kök hücre kaynağı olarak kullanılan kordon kanı bankalarının aracılığı ile kolay ulaşılabilir ve hedef lösemi olmak üzere birçok hastalıkların hücre ve olan immatür B ve T hücreleri 7 zenginleştirilmiştir edilir lenfomalar.
Kemik iliği içinde Prekürsör B-hücrelerinin yaygın olarak 8,9 phenotyped edilmiştir ve ayrı alt bu hücrelerin sıralamak için kullanılan spesifik hücre yüzey işaretleyicileri arasında bulunması ile tanımlanır. Normal B-hücre farklılaşması erken pro-B hücreleri ile başlayan ve olgunlaşmamış ya da naif B hücrelerinin sonuçlanan kemik iliğinde aşamalarında bir dizi ilerler. Görevan Zelm ve meslektaşları 10, pro-B hücreleri CD34 varlığı ve evre 2 geçiş (Pre-BI) olarak CD19 kazanılır karakterizedir. 3. Aşama (Ön BII) hücreler artık CD34 ekspres ve sitoplazmik IgM ifade etmeye başlayacak. Nihayet, evre 4 bir belirleyici özelliği (B hücreleri immatür) yüzey IgM ifadesidir. Bu protokolü açıklanan sıralama stratejisi ilk Caldwell ve arkadaşlarının 6 tarafından tanımlanan ve büyük ölçüde karmaşıklığı ve hücre sıralama deneyler gerçekleştirme maliyetini düşürür sadece 3 hücre yüzey belirteçlerinin kullanımını içerir edildi. Onların çalışmasında, CD45 arasında bir ilişki ve B-hücre farklılaşması aşamaları kurulmuştur. Bunlar kemik iliği, B-hücreleri CD45 ekspresyonu değişken düzeyleri görüntülemek görülmektedir. Özel olarak, yüksek düzeyde CD45 hücrelerinin yüzeyinde ifade edilen IgM ifade hücreleri (B-hücreleri olgunlaşmamış) karşılık olarak, CD45, orta derecede ifade edilen, bu cytopl ifade hücreler denkasmic IgM (pre-BII hücreleri), ve CD45 düşük seviyelerde ifade olanların (pre-BI hücreleri) sitoplazmik IgM ifade vermedi hücreleri karşılık geldi. Bu protokol, örneğin metil-, CpG adası iyileşme testi gibi, yüksek kaliteli nükleik asit gerektiren alt-metodlarda kullanılan göbek bağı kanı (Şekil 1), B-hücrelerinin (MIRA haberci alt kümeleri izole etmek için Caldwell ve arkadaşları tarafından geliştirilen 6 strateji kullanır ) 11 ve kantitatif gerçek zamanlı PCR. Yöntemi göbek kordon kanı dışındaki tüm B hücreleri tüketmek için manyetik boncuklar kullanarak ilk ayrılık istihdam ediyor ve sadece 3 antikorlar (CD34, CD19 ve CD45) ile boyanarak gerektirir. Kurtarıldı hücreleri B-hücre farklılaşması 4 aşamaları temsil: 1) CD34 +, CD19 + (geç pro-B ve pre-BI erken); 2) CD34 -; CD19 +, CD45 düşük (geç ön-BI); 3) CD34 -; CD19 +, CD45 med (pre-BII) ve 4) CD34 -; CD19 +; CD45 yüksek (immatür B hücreleri).
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolün başarısı üzerinde en büyük etkiye sahip faktör enkaz kirletici varlığıdır. Bir kordon kanı bankası kanı isteyen varsa bu kanın en kısa sürede toplama sonra mümkün sevk olması önemlidir. Buna ek olarak, lenfositoz olarak sınıflandırılan örnekleri lenfositlerin yüksek sayılar içeren, ancak bu örnekler prekürsör B-hücrelerinin yeterli sayıda yoktur ve kullanılmamalıdır. Biz kordon kanı en az 85 ml ile başlayan tavsiye habercisi altkümelerini her hücrelerin yeterli sayıda elde etme olasılığını artırmak için.
Bu yetişkin periferik kan ayrımları aksine, göbek kordonu kanı fractionating zaman mononükleer katmanı çoğunlukla kırmızı kan hücreleri 12 ile kontamine olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu protokol, kontamine trombositleri uzaklaştırmak için ilave bir yıkama aşamasını içerir. Kordon kanı mononükleer ayrımları anlatan Protokoller lizis adım t dahil öneririzİstenmeyen kırmızı hücreleri çıkarmak o. Kontaminasyonu enkaz üretir ve hücrenin tür başarısı üzerinde olumsuz bir etkisi vardır, çünkü biz bu adımı önermiyoruz.
Akış sitometrisi ile ayırt edilmesi gereken hücrelerin sayısını azaltmak için, bu önceki hücre sıralama için, bir B-hücresi zenginleştirme gerçekleştirmek için gereklidir. B-Hücre İzolasyon Kiti (B KLL) eşlik Miltenyi Biotec, tarafından sağlanan protokolü periferik kan için optimize edilmiş ve 10 milyon hücre başına 10 ul B KLL biotin antikor kokteyli kullanılmasını önerir edilmiştir. , CD4 (T hücreleri), CD11b (granülositler, monositler, makrofajlar), CD16 (NK hücreleri, makrofajlar, mast hücreleri), CD36 (trombosit), CD235a (eritroid hücreler); Bu adım, CD2 (NK hücreleri, T hücreleri) karşı antikorlar kullanan göbek kordon kanı olmayan B hücreleri tüketmek. Bu, eski kit pro-B hücreleri üzerinde mevcut olan CD43 karşı bir antikor içerir, çünkü tarif edilen kit olup, B-hücre izolasyon kiti II kullanımı için çok önemlidir. Bizim op sırasındaBu protokolün timization, biz B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul toplam bir pozitif hücre sıralama sonucu üretmek için yeterli olduğunu buldular. Ayrıca biz B KLL biotin antikor kokteyli az 5 olarak ul fazla kullanarak hücre sıralama üzerinde olumsuz etkileri olduğunu bulmuşlardır. Bu nedenle, biz çok 175-250000000 arasındaki toplam mononükleer hücre numaraları için B KLL biotin antikor kokteyli 40 ul kullanmanızı öneririz. Hücrelerin daha düşük ya da daha yüksek sayılar ile başlangıç durumunda buna uygun reaktifler büyütmek için gerekli olabilir.
B-hücre alt-popülasyonları ayırmak için kullanılabilecek belirteçler anlatan sayısız çelişkili yayınlar vardır. Tutarsızlık çoğu farklılaşma devam eden bir işlem olup hücre yüzey işaretleyicileri arasında varlığında veya yokluğunda tedrici bir şekilde yerine bir bütün ya da hiç bir şekilde meydana geldiği gerçeği ile açıklanabilir. / CD19 + ve CD45 + (yoğunluk düzeyini – Bu protokol CD34düşük), yüksek, orta ifade farklılaşma 6 ilerlemesini tekabül eden CD45 ekspresyonunun seviyesinde bir artış ile ön-BI, önceden II ve olgunlaşmamış B hücreleri ayırmak için kullanılmıştır. Pro-B hücreleri CD19 Bazılarına göre tarif edilmiştir + / CD34 + 13 diğerleri pro-B hücreleri CD19 olduğunu göstermiştir iken – / CD34 + ve pre-BI hücreler CD19 + / CD34 + 9,10 vardır. Bu farklar dayanarak biz geç pro-B hücreleri / erken pre-BI hücreleri CD19 + / CD34 + hücrelerin tayin etmişler. Bu stratejinin öncüsü hastalık akut lenfoblastik lösemi etkilenen hücrelere karşılık B hücrelerinin alt yalıtmak için geliştirilen dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, ilgi hücre alt tipi bağlı olarak kullanılabilecektir birden fazla ayırma stratejiler vardır.
Antikor-florokrom kombinasyonları kullanılabilir hücre sıralayıcı yeteneklerine göre seçilmelidir. Bir cins olarakl kural, sizin panelinde parlak florokrom en kalabalık antijen ve tersi etiketlemek için kullanılmalıdır. Özellikle çift-lekeli nüfus, bu gibi nadir olaylar belirlenmesinde, çifti ayrımcılık (Şekil 2B) yolluk stratejisinin hayati önem taşımaktadır. Bu, çift pozitif olayların antikorlar ve birbirlerine yapışık değil, sadece iki tek-boyanan hücreleri hem lekeli gerçekten tek hücre olmasını sağlar.
Yüksek hız, 4-yönlü hücre sıralama mutlaka kontrollü bir aerosol ortam oluşturur. Bu nedenle, canlı insan hücre sıralama büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yayınlandı emniyet ve dekontaminasyon kuralları mevcuttur ve sıralama 14 önce incelenir ve uygulamaya konulmalıdır. Kurumsal Biyogüvenlik Komiteleri veya eşdeğerleri gelen Onay sıralama öncesinde gerekli olabilir. Sıralama sonra uygun arındırma için, çamaşır suyu% 10 oranında bir nihai konsantrasyon için çöp bidonu ilave edilmelidir. Similarly, tüm örnekler boru şeklinde, hem de hemen alan bütün yüzeyleri tamamen yeni hazırlanmış bir% 10 çamaşır suyu solüsyonu ile arındırılır olmalıdır.
Özetle, bu protokol prekürsör B-hücrelerinin nadir nüfus elde etmek için bir strateji sağlar ve hematopoetik kök hücreleri ve T hücreleri immatür dahil kordon kanında bulunan herhangi nadir nüfusa yalıtmak için modifiye edilebilir. Son zamanlarda, immatür B hücreleri ilerlemiş HIV 15 bireylerin periferik kan tespit edilmiştir. Bu nedenle, bu yöntemin yarar kan kanseri çalışma ötesine uzanır. Son olarak, henüz akış sıralanmış hücreleri üzerinde gerçekleştirilen RNA izolasyon değil, ancak, bu yöntem, hücre sırasında hücreler RNeasy kiti trizol ya da bu gibi RLT eşdeğer bir RNA uyumlu bir çözelti içine doğrudan sıralanması sıralamak uyarı ile uyumlu olmalıdır Qiagen aracılığıyla kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma KT Ulusal Sağlık Enstitüleri (NCI R00 CA132784) tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature?. Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W. Fates of human B-cell precursors. Blood. 96 (1), 9-23 (2000).
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
