Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.
Abstract
Nabelschnurblut ist sehr für hämatopoetischen Vorläuferzellen in verschiedenen Linie Engagement Stufen bereichert. Wir haben ein Protokoll zur Isolierung Vorläufer-B-Zellen in vier verschiedenen Stadien der Differenzierung entwickelt. Da Gene exprimiert werden und epigenetische Modifikationen auftreten in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise ist es wichtig, zwischen Geweben und Zelltypen unterscheiden, um der Lage sein, Veränderungen im Genom und Epigenom, die zur Entwicklung der Krankheit führen, zu identifizieren. Dieses Verfahren kann auf jede Art von Zelle im vorliegenden Nabelschnurblut in jedem Stadium der Differenzierung angepasst werden.
Dieses Verfahren umfasst 4 wichtigsten Schritte. Zuerst werden mononukleäre Zellen durch Dichtezentrifugation getrennt. Zweitens werden B-Zellen angereichert mit Biotin konjugierten Antikörper, erkennen und Entfernung von Nicht-B-Zellen aus den mononukleären Zellen. Drittens werden die B-Zellen werden mit fluoreszent Zelloberflächenprotein spezifische Antikörper markiert einzelnen Stufenvon B-Zell-Entwicklung. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Zellen sortiert und einzelne Populationen werden zurückgewonnen. Die gewonnenen Zellen werden in ausreichender Menge und Qualität in nachgelagerten Nukleinsäureassays genutzt werden.
Introduction
Um Aberrationen, die in Krankheit zu identifizieren, ist es äußerst wichtig, dass wir gesunde Gewebe oder Zellen, die Gewebe oder Zelltyp von der Krankheit betroffen entsprechen verwenden. Ein Grund dafür ist, dass epigenetische Variation unter Gewebetypen verantwortlich ist für die Regulation der Genexpression und ist entscheidend für die Zelldifferenzierung während der normalen menschlichen Entwicklung 1,2. Ein zweiter Grund ist, dass aberrante gewebespezifischen Genregulation kann fatale Folgen auf normale Entwicklung haben und ist dafür bekannt, zu einer Vielzahl von Krankheitszuständen wie Krebs beitragen. Daher erfordert ein besseres Verständnis einer Krankheit, die hämatopoietische Zellen umfasst Kenntnisse gesunden hämatopoetischen Zellen.
Die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark verläuft durch systematische Abfolge von Ereignissen durch Veränderungen in der Expression von Zelloberflächen dadurch Marker 3. Studien mit erwachsenen Teilnehmergezeigt, dass Knochenmark enthält gewöhnlich eine geringe Anzahl von Vorläufer-B-Zellen 4,5; Erwägung pädiatrischen Studien mit Teilnehmern haben gezeigt, dass der Anteil der Vorläufer-B-Zellen in relativ hoher Individuen weniger als 5 Jahren 6 ist. Nabelschnurblut wurde als Quelle von hämatopoetischen Stammzellen zur Behandlung von Blut-verwandten Erkrankungen und malignen Erkrankungen verwendet werden, ist leicht erhältlich über Nabelschnurblutbanken und ist für unreifen B-Zellen und T 7, die die Zielzellen mehrerer Störungen, einschließlich Leukämie und sind angereichert Lymphome.
Vorläufer-B-Zellen im Knochenmark wurden ausgiebig 8,9 phänotypisiert und kann durch die Anwesenheit von spezifischen Zelloberflächen-Marker, die verwendet werden, diese Zellen in verschiedene Teilmengen sortiert werden können definiert werden. Normale B-Zell-Differenzierung verläuft über eine Reihe von Stufen im Knochenmark beginnend mit den frühesten Pro-B-Zellen und ihren Höhepunkt in unreifen oder naive B-Zellen. Nachvan Zelm und Kollegen 10 sind Pro-B-Zellen durch die Anwesenheit von CD34 und im Übergangsbereich zu Stufe 2 (Pre-BI) CD19 erfasst ist. Stage 3 (Pre-BII) Zellen nicht mehr CD34 und beginnen zu zytoplasmatische IgM auszudrücken. Schließlich ist ein bestimmendes Merkmal der Stufe 4 (unreifen B-Zellen) die Expression von Oberflächen-IgM. Die Sortiervorrichtung Strategie in diesem Protokoll beschrieben wurde zuerst von Caldwell und Kollegen 6 beschrieben und umfasst die Verwendung von nur 3 Zelloberflächenmarker das reduziert die Komplexität und die Kosten des Durchführens Zellsortierung Experimenten. In ihrer Arbeit wurde eine Beziehung zwischen CD45 und die Stufen des B-Zell-Differenzierung etabliert. Sie beobachteten, dass B-Zellen im Knochenmark variablen Niveaus der Expression von CD45 zeigen. Insbesondere Zellen, die hohe Spiegel von CD45 exprimiert zu Zellen, die Oberflächen-IgM exprimiert (unreifen B-Zellen) entsprach, entsprachen denen, die ein mittleres Niveau der CD45 exprimiert, um Zellen zu cytopl exprimiertasmic IgM (pre-BII Zellen), und diejenigen, die geringe Mengen an CD45 exprimiert entsprach Zellen, die nicht exprimieren hat cytoplasmatischen IgM (Prä-BI-Zellen). Dieses Protokoll verwendet die Strategie von Caldwell und Kollegen entwickelt, um sechs Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut (Abbildung 1), die in nachgeschalteten Assays erfordern hochwertige Nukleinsäuren wie der methylierten CpG-Insel Rückgewinnung Assay verwendet werden kann (MIRA isolieren ) 11 und quantitative Echtzeit-PCR-Assays. Das Verfahren eine anfängliche Trennung unter Verwendung von Magnetkügelchen, alle nicht-B-Zellen aus Nabelschnurblut abzureichern und erfordert Färbung mit nur drei Antikörper (CD34, CD19 und CD45). Die Zellen, die gewonnen werden repräsentieren 4 Stufen von B-Zell-Differenzierung: 1) CD34 +; CD19 + (späten Pro-B und frühen Pre-BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 niedrig (späte pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pre-BII), und 4) CD34 -; CD19 +; CD45 hoch (unreifen B-Zellen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Faktor mit dem größten Einfluss auf den Erfolg des Protokolls ist die Anwesenheit von kontaminierenden Verunreinigungen. Wenn Blut von einem anfordernden Nabelschnurblutbank ist es wichtig, dass das Blut versendet sobald nach der Entnahme wie möglich. Darüber hinaus enthalten Proben, die als Lymphozytose klassifiziert sind höhere Anzahl von Lymphozyten, aber diese Proben nicht über ausreichende Zahl von Vorläufer-B-Zellen und sollten nicht verwendet werden. Um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens ausreichende Anzahl von Zellen für jeden der Vorläufer Teilmengen empfiehlt beginnend mit mindestens 85 ml Nabelschnurblut erhöhen.
Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zu erwachsenen peripheren Blut Trennungen, wenn Fraktionieren Nabelschnurblut mononukleäre die Schicht oft mit roten Blutzellen 12 kontaminiert. Dieses Protokoll enthält eine zusätzliche Waschschritt zu verunreinigen Thrombozyten zu entfernen. Protokolle beschreiben mononukleären Trennungen aus Nabelschnurblut schlagen einschließlich einer Lyseschritt to Entfernen unerwünschter roten Blutkörperchen. Wir empfehlen nicht diesen Schritt, weil es verunreinigt Schutt produziert und hat einen negativen Einfluss auf den Erfolg der Zelle sort.
Um die Anzahl der Zellen, die durch Flusszytometrie unterschieden werden müssen reduzieren, ist es notwendig, eine B-Zell-Anreicherung vor Zellsortierung durchzuführen. Das Protokoll, das von Miltenyi Biotec, die den B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) begleitet, vorgesehen ist für peripheren Blut optimiert und empfiehlt die Verwendung von 10 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail pro 10 Millionen Zellen. Dieser Schritt verwendet Antikörper gegen CD2 (T-Zellen; NK-Zellen), CD4 (T-Zellen), CD11b (Granulozyten; Monozyten; Makrophagen), CD16 (NK-Zellen; Makrophagen; Mastzellen), CD36 (Thrombozyten), CD235a (erythroide Zellen) Nicht-B-Zellen aus dem Nabelschnurblut erschöpfen. Es ist wichtig, um den Bausatz beschrieben und nicht die B-Zell-Isolierungs-Kit II zu verwenden, weil der frühere Kit enthält einen Antikörper gegen CD43, die am vorliegenden Pro-B-Zellen ist. Während unserer opmierung des Protokolls, fanden wir, dass insgesamt 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail ausreicht, um eine positive Zelle Sortierungsergebnis erzeugen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass mit so wenig wie 5 ul mehrere der B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail negativen Auswirkungen auf die Zellen sortiert. Daher empfehlen wir mit 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail für insgesamt mononukleären Zellen Zahlen zwischen 175 bis 250.000.000. Wenn ausgehend von niedrigeren oder höheren Anzahl von Zellen kann es erforderlich sein, um die Reagenzien entsprechend skalieren.
Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die kollidierenden Marker, die verwendet werden, um zu unterscheiden Subpopulationen von B-Zellen kann. Die meisten der Diskrepanz kann durch die Tatsache, dass die Differenzierung ein kontinuierlicher Prozess ist und dass das Vorhandensein oder Fehlen von Zelloberflächenmarkern tritt in allmählicher Weise anstatt in einer alles oder nichts Weise erläutert. In diesem Protokoll CD34 – / CD19 + und die Intensitätsstufe der CD45 + (niedrig, mittel, hoch) wurde verwendet, um die Expression Pre-BI, BII pre-und unreife B-Zellen, die mit einer Erhöhung der Höhe der CD45-Expression, die dem Fortschreiten der Differenzierung 6 unterscheiden. Pro-B-Zellen wurden von einigen beschrieben worden CD19 sein + / CD34 + 13, während andere haben gezeigt, dass Pro-B-Zellen CD19 sind – / CD34 + und Pre-BI-Zellen sind CD19 + / CD34 + 9,10. Basierend auf dieser Diskrepanzen haben wir die CD19 + / CD34 +-Zellen so spät Pro-B-Zellen / frühen Pre-BI-Zellen bezeichnet. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Strategie entwickelt wurde, um Untergruppen von Vorläufer-B-Zellen, die zu den Zellen von der Krankheit betroffen akuter lymphatischer Leukämie entsprechen isolieren. Es gibt jedoch mehrere Sortieranlagen Strategien, die eingesetzt je nach Zellentyp Subtyp von Interesse sein kann.
Antikörper-Fluorochrom Kombinationen sollte basierend auf den Fähigkeiten des Zellsorters ausgewählt werden. Als Gattungenl Regel der hellste Fluorochrom in Ihrem Panel sollte verwendet werden, um die am wenigsten bevölkerten Antigen und vice versa zu kennzeichnen. In Erkennen Doppel-gefärbten Populationen, insbesondere seltene Ereignisse wie diese, ist Dublett Diskriminierung (2B) ein ganz wichtiger Teil der Gating-Strategie. Dadurch wird sichergestellt, dass die Doppel-positiven Ereignisse sind wirklich einzelne Zellen mit beiden Antikörpern und nicht nur zwei Einzel-gefärbten Zellen eingehalten miteinander gefärbt.
Hohe Geschwindigkeit, 4-Wege-cell sorting zwangsläufig schafft eine kontrollierte Aerosol Umwelt. Daher sollte lebenden menschlichen Zellsortierung mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Veröffentlicht Sicherheit und Dekontamination Richtlinien sind verfügbar und sollten überprüft und vor der Sortierung 14 umgesetzt werden. Genehmigung von Institutional Biosafety Ausschüsse oder deren Äquivalente können vor der Sortierung erforderlich. Für eine ordnungsgemäße Dekontamination nach dem Sortieren sollte Bleichmittel zum Abfallbehälter zu einer Endkonzentration von 10% zugesetzt werden. Similarly, sollten alle Proben Schlauch sowie alle Flächen in der unmittelbaren Umgebung gründlich mit einem frisch zubereiteten 10% Bleichlösung dekontaminiert werden.
Zusammengefasst stellt das Protokoll eine Strategie zum Erhalt seltener Populationen von Vorläufer B-Zellen und kann modifiziert werden, um jegliche seltenen Population in Nabelschnurblut einschließlich hämatopoetischen Stammzellen und unreifen T-Zellen zu isolieren. Kürzlich wurden unreife B-Zellen im peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittener HIV 15 identifiziert. Daher erstreckt sich die Nützlichkeit dieser Methode jenseits der Studie von Blutkrebs. Schließlich haben wir noch nicht RNA Isolationen auf die Fließeigenschaften sortierten Zellen durchgeführt, aber diese Methode sollte anpassungsfähig sein, mit dem Vorbehalt, dass während Zellsortierung die Zellen direkt sollte in Trizol oder einer gleichwertigen RNA kompatible Lösung wie RLT sortiert werden aus dem RNeasy Kit verfügbar über Qiagen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) unterstützt, um KT
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
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