Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

1. Isolamento de células mononucleares do sangue do cordão umbilical Preparar o tampão PBS-EDTA-se 5 ml de soro bovina solução de albumina (BSA) a 95 ml de tampão de lavagem (diluição de 1:20). Degas tampão e a manter o tampão no gelo IMPORTANTE:. Falha para desgaseificar o tampão pode resultar em menos do que os melhores resultados quando se isola CD19 + células-B, porque as bolhas podem bloquear a coluna de isolamento. Preparar 50 ml por tubos cónicos de centrifugação de gradiente de densidade. Determinar o número de tubos necessários para processar o sangue do cordão umbilical (um tubo pode processar 8 ml de sangue) e adicionar 15 ml de Ficoll-Paque PLUS para cada tubo. Diluir 8 ml de sangue de cordão, com 24 ml de DPBS (1X) e cuidadosamente a mistura da camada de sangue diluído cabo no topo do Ficoll-Paque PLUS em cada um dos tubos de 50 ml. Não misture o sangue e Ficoll-Paque PLUS IMPORTANTE:. Para evitar a mistura do sangue do cordão umbilical e Ficoll-Paque PLUS, manter o tubo em um ângulo de 45 graus emistura da camada do sangue lentamente. Centrifugar a 400 xg durante 40 min a 20 ° C. As células mononucleares (MNC) permanecerá no plasma-Ficoll-Paque PLUS de interface enquanto granulócitos e eritrócitos de sedimentos, devido à densidade mais elevada a uma pressão osmótica de Ficoll-Paque PLUS. Etiqueta sete de 5 ml de fundo redondo de tubos a serem utilizados na parte 3, com a data de amostragem ID, e o seguinte: Tubo Etiqueta Propósito 1 Imaculado As células não coradas para citometria de fluxo durante a normalização 2 7AAD Para determinar a viabilidade de citometria de fluxo durante 3 + + + Contém as células que serão classificados 4 34 + Para a coleta de células CD34 + / CD19 +(Tarde pró-B – início de pré-BI), as células 5 45 baixo Para a coleta de CD34 – / CD19 + / CD45 baixo (pré-BI), as células 6 45 med Para a coleta de CD34 – / CD19 + / CD45 med (pré-BII), as células 7 45 de alta Para a coleta de CD34 – / CD19 + / CD45 alta (B) células imaturas Casaco tubos 4, 5, 6, e 7 com 2% de FBS e colocar todos os tubos em gelo. Aspirar a camada de plasma superior com cuidado e evitar o contato com a camada de células mononucleares. Utilizando uma pipeta de vidro de 10 ml, transferir cuidadosamente a camada de células mononucleares de um novo tubo de 50 ml. Reúne-se as células mononucleares a partir de três tubos em conjunto dentro de um tubo simples 50 ml. Encher o tubo com PBS, mistura suavemente e centrifugar a 300 xg durante 10 min a20 ° C. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Repita 1x. Após a primeira lavagem, ressuspender as pastilhas e transferir para um tubo de 50 ml único cónico. Gentilmente ressuspender o sedimento de células em 200 ul de PBS. Remover 1 ml de suspensão de células, adicione-a 1 ml de PBS, num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e retiradas para contagem (contagem de células após a colocação da suspensão de células de 50 ml na centrífuga). Encher o tubo com PBS e centrifugar a 200 xg durante 15 min para remover as plaquetas. Remover o sobrenadante completamente sem perturbar o sedimento celular. 2. Modificado isolamento de células B a partir de células mononucleares utilizando a separação MACS Ressuspender o sedimento do passo 1.7 com 160 ul de frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS. Adicionar 40 ul de B-CLL cocktail anticorpo biotina. Pipetar para misturar bem e incubar durante 10 min a 4 ° C. Lave as células – adicionar 1 ml frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS por 10 milhões de células (células number determinado no passo 1.7) e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente e, em seguida, voltar a suspender o sedimento de células em 320 ul de frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS. Adicionar 80 ul de anti-biotina micropérolas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C. Lave as células – adicionar 1 ml frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS por 10 milhões de células e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Ressuspender até 100 milhões de células em 500 uL de frio (4 ° C) de tampão de EDTA-PBS. Volume de tampão de acordo com a escala do número de células. Prepare MACS Colunas e Separadores de MACS durante a centrifugação (Passo 2.5). Colocar uma coluna LS no campo magnético do separador MACS, adicionar 3 ml de frio (4 ° C) de tampão PBS-EDTA sobre a coluna e permitir que o tampão para gotejar através da coluna. Use um recipiente para pegar o fluxo através. Descartar o fluxo através. Coloque um tubo cónico de 50 ml, abaixo da coluna e pipetar a suspensão de células na coluna. Permitir que as células não marcadas para gotejar through a coluna e para dentro do tubo cónico de 50 ml. IMPORTANTE: Estas são as células que irão ser utilizados para a rotulagem de anticorpos e separação de células. Não descarte o fluxo através. Para recuperar todas as células a partir do passo 2.5, adicionar 1 ml de uma adicional de frio (4 ° C) de tampão PBS-EDTA para as paredes do tubo cónico. Misturar suavemente e pipetar a suspensão de células remanescente na coluna. Repita 1x. Avance para o passo 2,8 utilizando as células não marcadas recolhidos no tubo cónico, depois de passar através da coluna. Encher o tubo cónico contendo células não marcadas com PBS e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Cuidadosamente remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Adicionar 200 ul de tampão PBS-EDTA e gentilmente ressuspender as células. 3. Rotulagem de anticorpos e Preparação para separação de células Aspirar 1 ul de suspensão de células e colocar num tubo rotulado "sem mancha" (Passo 1.4). Adicionar 500 de tampão de EDTA-PBS e armazenar o tubo em gelo. Adicionar 20ul de cada anticorpo (CD19, CD34 e CD45) por milhão de células em suspensão de células remanescente. Misturar bem e colocar o tubo no escuro durante 30 min à TA. Anticorpos CD são sensíveis à luz, execute as etapas 2-4 com as luzes apagadas. Após 30 min de incubação com os anticorpos, aspirar 40 ul da suspensão de células e colocá-lo no tubo rotulado "7AAD". Adicionar 1 ml de PBS para dentro do tubo e centrifugar a 500 xg durante 2 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 100 uL de tampão de ligação. Adicionar 7 uL de 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubar no escuro durante 10 min à TA. Durante o passo de incubação de 10 min completa 3.4. Adicionar PBS para a parte superior do tubo contendo as células restantes marcadas com anticorpos de CD. Centrifuga-se o tubo a 500 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante, adicionar 500 ul de tampão PBS-EDTA e ressuspender o sedimento celular. Transfira a totalidade do volume de suspensão de células no tubo rotulado "+ + +". A recuperação da totalidade da suspensão de células de umdd mais 1 ml de tampão de EDTA-PBS ao tubo cónico de 50 ml e de transferência para o tubo rotulado "+ + +". Após incubação (passo 3.3), adicionam-se 300 ul de tampão de ligação para dentro do tubo 7AAD. O "imaculada", "7AAD" e "+ + +" e as amostras de "34 +", "45 baixo", "45 med" e "altos" tubos 45 estão prontos para a citometria de fluxo. 4. A classificação de células usando o citómetro de fluxo MoFlo XDP Set-up MoFlo para classificação: Alinhar lasers; estabilizar fluxo de gotículas; determinar atraso gota. Prepare os controles de cor única compensação usando Invitrogen ABC Rato talão kit (ou similar) de acordo com as instruções do fabricante. Executar os controlos de cor individuais, ajustando as tensões dos canais de fluorescência para uma separação óptima das populações positivas e negativas. Definir coeficientes de compensação e aplicar parâmetro compensada para protocolo de coleta. Restabelece-se coeficientes de compensação de cada vez que um novo lote de anticorpo é obtido. Criar protocolo incluindo lotes como se mostra na Figura 2. Executar amostra sem manchas, definir tensão e ganho para dispersão de frente e de lado, e identificar negativos populações de fluorescência. Porque a recuperação do ADN é o objetivo do tipo, o limite deve ser definido baixa (≤ 1%), de forma que o DNA contendo detritos não contaminar as amostras recuperadas. * Certifique-se de que o sistema de evacuação Aerosol está funcionando em todos os momentos que vivem as células humanas estão sendo executados no MoFlo. Executar uma pequena alíquota de + + + de amostra (~ 50.000 eventos) para definir a estratégia gating (Figura 2). Porque os progenitores de células B não dispersam de forma idêntica para amadurecer as células B, o CD19 backgate ungated + / CD34 + na população do FSC vs SSC a assegurar a delimitação de linfócitos inclui potenciais células pró-B. A partir dessa amostra também definir a população negativo de fluorescência para 7AAD. Execute o exemplo 7AAD para determinar a viabilidade da amostra. Apenas as células de classificação a partir de uma amostra com alta viabilidade noinício (≥ 95%) como as células mortas vai manchar de forma indiscriminada e pode contaminar as populações de classificação. Configure decisões de classificação para coletar quatro populações: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 – / CD45 baixa; CD19 + / CD34 – / med CD45 e CD19 + / CD34 – / CD45 alta. Incluir o linfócito e portões discriminação doublet nas decisões de classificação de todas as populações. Para evitar obstruções na ponta de classificação, filtro + + + amostra através de um filtro de 40 um de células imediatamente antes da triagem e re-se qualquer filtro agregação ocorre na amostra durante a classificação. Classificar as células para dentro de tubos de recolha (Passo 1.4) revestidas com FBS a 2% em PBS, em um suporte do tubo arrefecido com gelo ou embalado. Imediatamente após a classificação é completada, extrair DNA.