عزل مجموعات فرعية B-الخلية السلائف من دم الحبل السري
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول للعزل مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف من دم الحبل السري. يمكن استخراجها كمية كافية ونوعية الأحماض النووية من الخلايا المستخدمة في المقايسات واللاحقة الاستفادة من DNA أو RNA.
Abstract
والتخصيب دم الحبل السري عن خلايا المكونة للدم السلف في مختلف مراحل التزام النسب. قمنا بتطوير بروتوكول للعزل خلايا B-السلائف في أربع مراحل مختلفة من التمايز. لأن يتم التعبير عن الجينات وتحدث تعديلات جينية على نحو الأنسجة محددة، فمن الأهمية بمكان التمييز بين الأنسجة وأنواع الخلايا من أجل أن تكون قادرة على تحديد التغيرات في الجينوم وepigenome التي قد تؤدي إلى تطوير المرض. ويمكن تكييف هذه الطريقة إلى أي نوع من الخلايا في الوقت الحاضر دم الحبل السري في أي مرحلة من التمايز.
هذه الطريقة تشمل 4 خطوات رئيسية. أولا، يتم فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحيدات النوى الكثافة. الثانية، هي المخصب B-الخلايا باستخدام الأجسام المضادة مترافق البيوتين التي تعترف وإزالة الخلايا غير B-من الخلايا وحيدات النوى. وfluorescently المسمى الثالث خلايا B مع الأجسام المضادة الخلايا بروتين السطح النوعي لمراحل الفرديةمن B-الخلية التنمية. وأخيرا، يتم فرز الخلايا fluorescently المسمى ويتم استرداد السكان الفردية. الخلايا هي تعافى من كمية ونوعية كافية لاستخدامها في فحوصات الحمض النووي المصب.
Introduction
من أجل تحديد الانحرافات التي تكون موجودة في مرض، فمن الأهمية بمكان أن نستخدم خلايا الأنسجة السليمة أو التي تتوافق مع نوع الأنسجة أو الخلايا المتضررة من هذا المرض. وأحد أسباب ذلك هو أن الاختلاف بين أنواع الأنسجة جينية مسؤولة عن تنظيم التعبير الجيني وأمر حاسم بالنسبة لتمايز الخلايا العادية خلال 1،2 التنمية البشرية. والسبب الثاني هو أن الأنسجة الشاذة تنظيم جين معين قد يكون له عواقب وخيمة على التطور الطبيعي وكما هو معروف للمساهمة في العديد من الحالات المرضية بما فيها السرطان. لذلك، فهم أفضل للمرض الذي ينطوي على الخلايا المكونة للدم يتطلب معرفة الخلايا المكونة للدم صحية.
تطوير الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم من خلال عائدات أمر منهجي للأحداث التي تتميز التغييرات في التعبير عن وضع العلامات سطح الخلية 3. الدراسات التي تنطوي على المشاركين الكبار لهاتبين أن نخاع العظام يحتوي عادة على عدد قليل من خلايا السلائف B-4،5، في حين دراسة شملت الأطفال المشاركين أظهرت أن نسبة السلائف الخلايا B-مرتفعة نسبيا في الأفراد أقل من 5 سنوات من العمر 6. يتم استخدام دم الحبل السري كمصدر للخلايا الجذعية المكونة للدم في علاج اضطرابات الدم والأورام الخبيثة ذات الصلة، في متناول الجميع عن طريق البنوك دم الحبل السري وغير المخصب لخلايا غير ناضجة وB T 7 التي هي الخلايا المستهدفة من اضطرابات متعددة بما في ذلك سرطان الدم و اللمفومات.
تم السلائف الخلايا B-في نخاع العظام phenotyped على نطاق واسع و8،9 يمكن تعريف عن وجود علامات محددة سطح الخلية التي يمكن استخدامها لفرز هذه الخلايا إلى مجموعات فرعية متميزة. حصيلة طبيعية تمايز الخلايا B-من خلال سلسلة من المراحل في نخاع العظام بدءا من الخلايا الموالية أقرب-B وبلغت ذروتها في غير ناضجة أو السذاجة خلايا B. وفقالZelm فان وزملاؤه 10، وتتميز الخلايا الموالية-B من خلال وجود CD34 والانتقال إلى المرحلة 2 (ما قبل BI) ويتم الحصول CD19. المرحلة 3 (ما قبل BII) الخلايا لم تعد صريح CD34 وتبدأ في التعبير عن الغلوبولين المناعي حشوية. وأخيرا، السمة المميزة للمرحلة 4 (غير ناضجة الخلايا البائية) هو تعبير عن الغلوبولين المناعي السطحية. وكان أول وصف الاستراتيجية الفرز المبينة في هذا البروتوكول من قبل كالدويل وزملاؤه 6 و يشمل استخدام سوى 3 علامات سطح الخلية مما يقلل كثيرا من تعقيد وتكلفة إجراء التجارب الفرز الخلية. في عملهم، وقد تم تأسيسها وجود علاقة بين CD45 ومراحل تمايز الخلايا B-. ولاحظ الباحثون أن الخلايا B-في نخاع العظم عرض مستويات متفاوتة من التعبير عن CD45. تقابل تلك التي أعربت عن المستوى المتوسط من CD45 على وجه التحديد، والخلايا التي عبرت عن مستويات عالية من CD45 تتوافق مع الخلايا التي أعرب الغلوبولين المناعي السطحية (غير ناضجة الخلايا البائية)، إلى الخلايا التي أعرب cytoplتقابل asmic الغلوبولين المناعي (الخلايا ما قبل BII)، وتلك التي أعرب انخفاض مستويات CD45 إلى الخلايا التي لم يبد الغلوبولين المناعي حشوية (BI قبل الخلايا). هذا البروتوكول يستخدم استراتيجية التي وضعتها كالدويل وزملاؤه 6 إلى عزل مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف من دم الحبل السري (الشكل 1) والتي يمكن استخدامها في فحوصات عالية المصب تتطلب نوعية الأحماض النووية مثل مقايسة الجزيرة الانتعاش ميثليته-الدليل السياسي الشامل (MIRA ) 11 والكمية في الوقت الحقيقي PCR المقايسات. الأسلوب يعمل على فصل الأولية باستخدام الخرز المغناطيسي في استنزاف كل الخلايا غير B من دم الحبل السري، ويتطلب سوى 3 تلطيخ مع الأجسام المضادة (CD34، CD19 CD45 و). الخلايا التي يتم استردادها يمثل 4 مراحل تمايز الخلايا B-: 1) CD34 +؛ CD19 + (الراحل) الموالية-B وأوائل قبل BI؛ 2) CD34 -؛ CD19 +؛ CD45 منخفضة (أواخر ما قبل BI)؛ 3) CD34 -؛ CD19 +؛ CD45 ميد (قبل BII)؛ و 4) CD34 -؛ CD19 +؛ CD45 عالية (غير ناضجة الخلايا B-).
Protocol
Representative Results
Discussion
العامل الذي له أكبر الأثر على نجاح البروتوكول هو وجود تلوث الحطام. إذا طلب الدم من الحبل بنك الدم فمن المهم أن يكون الدم شحنها في أقرب وقت ممكن بعد جمع. وبالإضافة إلى ذلك، والعينات التي تصنف على أنها تحتوي على كثرة اللمفاويات أعداد أكبر من الخلايا الليمفاوية، ولكن هذه العينات لم يكن لديك عدد كاف من خلايا B-السلائف ويجب عدم استخدامها. لزيادة احتمال الحصول أعداد كافية من الخلايا لكل من مجموعات فرعية السلائف نوصي بدءا لا يقل عن 85 مل من دم الحبل السري.
من المهم أن نلاحظ أنه على عكس الكبار فصل الدم المحيطي، عندما تجزئة دم الحبل السري وغالبا ما تكون ملوثة وحيدات النوى مع طبقة خلايا الدم الحمراء 12. هذا البروتوكول يتضمن خطوة إضافية لإزالة غسيل الصفائح الدموية تلويث. البروتوكولات التي تصف فصل النوى من دم الحبل السري تشير بما في ذلك تحلل ر خطوةس إزالة الخلايا الحمراء غير المرغوب فيها. لا نوصي بهذه الخطوة لأنها تنتج الحطام وتلويث له تأثير سلبي على نجاح هذا النوع الخلية.
من أجل الحد من عدد الخلايا التي يجب أن تتميز التدفق الخلوي من الضروري إجراء تخصيب الخلية B-قبل الفرز الخلية. وقد تم تحسين البروتوكول التي تقدمها بيوتيك Miltenyi، الذي يصاحب كيت عزل الخلايا B-(B-CLL)، لالدموية المحيطية وتوصي باستخدام الأجسام المضادة البيوتين 10 ميكرولتر B-CLL كوكتيل بنسبة 10 مليون خلية. هذه الخطوة يستخدم الأجسام المضادة ضد CD2 (خلايا T وخلايا NK)، CD4 (الخلايا T)، CD11b (المحببة؛ حيدات؛ الضامة)، CD16 (خلايا NK؛ الضامة؛ الخلايا البدينة)، CD36 (الصفائح الدموية)، CD235a (خلايا محمر) في استنزاف غير B الخلايا من دم الحبل السري. من المهم أن استخدام عدة وصف وليس B-II زنزانة انفرادية بسبب عدة عدة يحتوي على الأجسام المضادة السابق ضد CD43 التي هي موجودة على الخلايا الموالية-B. خلال المرجع لديناtimization من هذا البروتوكول، وجدنا أن ما مجموعه 40 ميكرولتر من الكوكتيل B-CLL الأجسام المضادة البيوتين كافية لإنتاج نوع الخلايا نتيجة إيجابية. وبالإضافة إلى ذلك وجدنا أن استخدام اقل من 5 ميكرولتر أكثر من الكوكتيل B-CLL الأجسام المضادة البيوتين لها آثار سلبية على نوع الخلية. ولذلك، فإننا نوصي بشدة باستخدام 40 ميكرولتر من الكوكتيل B-CLL الأجسام المضادة البيوتين لمجموع أعداد الخلايا وحيدات النوى بين 175-250،000،000. إذا بدءا بأعداد أقل أو أعلى من الخلايا قد يكون من الضروري لقياس الكواشف وفقا لذلك.
هناك العديد من المنشورات متضاربة تصف العلامات التي يمكن أن تستخدم لتمييز المجموعات الفرعية من السكان من الخلايا B-. ويمكن تفسير معظم التفاوت من خلال حقيقة أن التمايز هو عملية مستمرة وأن وجود أو عدم وجود علامات سطح الخلية يحدث بطريقة تدريجية في بدلا منها بطريقة الكل أو لا شيء. في هذا البروتوكول CD34 – / + CD19 ومستوى شدة CD45 + (وقد استخدم منخفضة، متوسطة التعبير، وارتفاع) لتمييز ما قبل BI، قبل BII وغير ناضجة الخلايا B-مع زيادة في مستوى CD45 التعبير الموافق تطور التمايز 6. وقد وصفت الموالية للخلايا B البعض أن CD19 + / CD34 + 13 في حين أن آخرين قد أظهرت أن الخلايا الموالية-B هي CD19 – / + CD34 وقبل BI الخلايا CD19 + / CD34 + 9،10. على أساس هذه التناقضات عينت نحن CD19 + / CD34 + الخلايا كخلايا الموالية-B المرحوم / أوائل الخلايا ما قبل BI. من المهم أن نلاحظ أن وضعت هذه الاستراتيجية لعزل مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف التي تتوافق مع الخلايا المتضررة من مرض سرطان الدم الليمفاوي الحاد. ومع ذلك، هناك عدة استراتيجيات الفرز التي يمكن استخدامها تبعا لنوع فرعي من الخلية الفائدة.
يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة ملون تألقي مجموعات على أساس قدرات فارز الخلية المتاحة. باعتبارها جنساوينبغي أن تستخدم ل القاعدة، ألمع ملون تألقي في لوحة لتسمية مستضد الأقل سكانا، والعكس بالعكس. في الكشف عن ضعف الملطخة السكان، وخاصة الأحداث النادرة مثل هذه، صدرة التمييز (الشكل 2B) هو جزء مهم من استراتيجية حيوية المعزولة. وهذا يضمن أن الأحداث الإيجابية انقر نقرا مزدوجا هي خلايا وحيدة حقا ملطخة كل الأجسام المضادة وليس مجرد اثنين واحد الملطخة الخلايا انضمت إلى بعضها البعض.
عالية السرعة، وطريقة الفرز 4-الخلية يخلق بالضرورة بيئة الهباء الجوي للرقابة. ولذلك، ينبغي أن يتم تنفيذ الحية الفرز الخلية البشرية بعناية كبيرة. نشرت السلامة وإزالة التلوث المبادئ التوجيهية متاحة وينبغي استعراض وتنفيذ هذا النوع قبل 14. قد تكون هناك حاجة موافقة من لجان السلامة الأحيائية المؤسسية أو ما يعادلها قبل الفرز. لإزالة التلوث المناسبة بعد الفرز، ينبغي إضافة التبييض إلى حاوية النفايات إلى تركيز النهائي من 10٪. SImilarly، ينبغي جميع أنابيب العينات وكذلك جميع الأسطح في المنطقة المجاورة تماما مع تطهير حل الطازجة التبييض 10٪.
وباختصار، يتيح هذا البروتوكول للحصول على استراتيجية السكان نادرة من السلائف الخلايا B-، ويمكن تعديله لعزل أية مجموعة من السكان نادرة موجودة في دم الحبل السري الخلايا الجذعية المكونة للدم بما في ذلك وغير ناضجة الخلايا التائية. مؤخرا، تم تحديد خلايا غير ناضجة B في الدم المحيطي من الأفراد مع فيروس نقص المناعة البشرية المتقدمة 15. ولذلك، فإن فائدة هذه الطريقة يمتد إلى أبعد من دراسة سرطان الدم. وأخيرا، فإننا لم نقم حتى الآن العزلة RNA على تدفق الخلايا مصنفة، ولكن هذا الأسلوب يجب أن تكون قابلة للتكيف مع التحذير من أن الخلية أثناء الفرز يجب أن يتم فرز الخلايا مباشرة في trizol أو حلا RNA مكافئ متوافق مثل RLT من عدة RNeasy من خلال QIAGEN.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NCI R00 CA132784) إلى KT
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature?. Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W. Fates of human B-cell precursors. Blood. 96 (1), 9-23 (2000).
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
