בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.
Abstract
דם חבל טבור מועשר לתאי אבות היווצרות דם בשלבי מחויבות שושלת שונים. פתחנו פרוטוקול לבידוד מבשר תאי B בארבעה שלבים שונים של בידול. בגלל גנים בא לידי ביטוי ושינויי epigenetic להתרחש באופן ספציפי רקמות, הוא חיוני, כדי להבדיל בין רקמות וסוגי תאים כדי להיות מסוגל לזהות שינויים בגנום וepigenome שעלול להוביל להתפתחות של מחלה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל סוג של תא בהווה דם טבורים בכל שלב של דיפרנציאציה.
שיטה זו כוללת 4 שלבים עיקריים. ראשית, תאי mononuclear מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות. שנית, תאי B מועשרים באמצעות נוגדנים מצומדות ביוטין שמכירים ולהסיר תאי B שאינם מתאי mononuclear. שלישית את B-תאים מסומנים fluorescently עם נוגדני חלבון בתא שטח ספציפיים לשלבים בודדיםהתפתחות תא B-. לבסוף, את התאים שכותרתו fluorescently מסודרים ואוכלוסיות בודדות הם התאוששו. התאים התאוששו הם בכמות ובאיכות מספקות כדי להיות מנוצלת במבחני חומצות גרעין במורד זרם.
Introduction
על מנת לזהות את הסטיות שנמצאות במחלה, חשוב וחיוני שאנו משתמשים רקמות או תאים שמתאימים לסוג הרקמה או תא המושפע מהמחלה בריאות. אחת סיבות לכך היא שוריאצית epigenetic בין סוגי רקמות היא אחראית לויסות התבטאות של גנים שהן קריטי להתמיינות תאים במהלך ההתפתחות האנושית 1,2 הנורמלי. סיבה שנייה היא שהרגולציה של הגנים ספציפית החריגה הרקמה עלולה להיות השלכות חמורות על התפתחות נורמלית וידועה לתרום למספר רב של מצבי מחלה, כוללים סרטן. לכן, הבנה טובה יותר של מחלה המערבת תאי hematopoietic דורשת ידע בתאי hematopoietic בריאים.
הפיתוח של תאי hematopoietic בתמורת מח העצם באמצעות סדר שיטתי של אירועים המתאפיינים בשינויים בביטוי של סמנים פני תא 3. מחקרים שכלל משתתף מבוגרים ישהראה כי מוח עצם מכיל בדרך כלל מספר נמוך של מבשר תאי B 4,5, ואילו מחקרים שכלל ילדי משתתפים הראו כי אחוז מבשר תאי B הוא גבוה יחסית אצל אנשים פחות מ 5 שנים של גיל 6. דם חבל טבור משמש כמקור לתאי גזע hematopoietic בטיפול בהפרעות ומחלות ממאירות הקשורות בדם, הוא זמין דרך בנקי דם טבורים ומועשר לB לא בוגר ותאי T 7 שהם תאי המטרה של הפרעות רבות, כולל לוקמיה ו לימפומה.
מבשר תאי B במח העצם כבר phenotyped הרחבת 8,9 ויכול להיות מוגדר על ידי הנוכחות של סמנים בתא שטח ספציפיים שניתן להשתמש בם כדי למיין תאים אלה לקבוצות משנה נפרדות. תמורה נורמלית B-cell בידול באמצעות סדרה של שלבים במח העצם, החלו בתאים המוקדמים פרו-B וכלה בתאי B בשלים או נאיביים. פיולאן Zelm ועמיתים 10, תאים פרו-B מאופיינים על ידי הנוכחות של CD34 ובמעבר לשלב 2 (Pre-BI) CD19 נרכש. שלב 3 (Pre-BII) תאים אינם מפורשים CD34 ולהתחיל לבטא IgM cytoplasmic. לבסוף, מאפיין בולט של שלב 4 (לא בוגר תאי B) הוא הביטוי של IgM פני שטח. אסטרטגית המיון המתואר בפרוטוקול זה תואר לראשונה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 וכוללת את השימוש של רק 3 סמנים בתא שטח אשר מקטינים מאוד את המורכבות והעלות של ביצוע ניסויי מיון תא. בעבודתם, יחסים בין CD45 ושלבי התמיינות תא B הוקמו. הם הבחינו כי B-תאים במח עצם הצגת רמות משתנות של ביטוי של CD45. באופן ספציפי, תאים שהביעו רמות גבוהות של CD45 התכתבו לתאים המבטאים את IgM משטח (-B תאים לא בשלים), אלה שהביעו רמה בינונית של CD45 התכתבו לתאים שהביעו cytoplasmic IgM (תאים טרום BII), ואלה שהביעו רמות נמוכות של CD45 התכתב לתאים שלא מבטאים IgM cytoplasmic (תאים טרום BI). פרוטוקול זה משתמש באסטרטגיה שפותחה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B מדם הטבורי (איור 1) אשר ניתן להשתמש במבחנים הדורשים זרם חומצות גרעין באיכות גבוהה כגון assay התאוששות האי מפוגל-CPG (מירה ) 11 ומבחנים PCR כמותיים בזמן אמת. השיטה מעסיקה הפרדה ראשונית באמצעות חרוזים מגנטיים לרוקן את כל התאים שאינם B מדם חבל טבור ודורשת הכתמה עם רק 3 נוגדנים (CD34, CD19 וCD45). התאים שהם התאוששו מייצגים 4 שלבי התמיינות תא B: 1) CD34 +; CD19 + (מאוחר פרו B-ובתחילה מראש BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 הנמוך (מאוחר מראש BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 מד (לפני BII); ו4) CD34 -; CD19 +; CD45 גבוה (לא בשל תאי B).
Protocol
Representative Results
Discussion
הגורם בעל ההשפעה הגדולה ביותר על הצלחתו של הפרוטוקול הוא הנוכחות של זיהום פסולת. אם מבקש דם מבנק דם טבורים חשוב לי הדם נשלח מייד לאחר גבייה ככל האפשר. בנוסף, דגימות שסווגו כlymphocytosis להכיל מספרים גבוהים יותר של לימפוציטים, אך הדגימות הללו אין מספרים מספיקים של מבשר תאי B ולא צריך להיות בשימוש. כדי להגדיל את ההסתברות לקבלת כמות מספקת של תאים לכל אחת מקבוצות המשנה המבשר אנו ממליצים מתחילים עם לפחות 85 מ"ל של דם טבורים.
חשוב לציין כי בניגוד להפרדות דם היקפיות בוגרות, כאשר fractionating דם טבורי שכבת mononuclear לעתים קרובות מזוהמת בתאי דם אדומים 12. פרוטוקול זה כולל שטיפת צעד נוסף כדי להסיר טסיות מזהמות. פרוטוקולים מתארים הפרדות mononuclear מדם הטבורי מציעים כולל לא צעד תמוגהo להסיר תאים אדומים לא רצויים. אנו לא ממליצים על הצעד הזה, כי זה מייצר פסולת מזהמת ויש לו השפעה שלילית על ההצלחה של סוג התא.
על מנת להקטין את מספר התאים שצריכים להיות מכובדים על ידי הזרימה cytometry יש צורך לבצע העשרת תא B לפני מיון תא. הפרוטוקול המסופק על ידי Miltenyi BIOTEC, המלווה את ערכת בידוד תא B (B-CLL), כבר מותאם לדם היקפי וממליץ להשתמש 10 קוקטייל μl B-CLL ביוטין נוגדן לכל 10 מיליון תאים. צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים נגד CD2 (תאי T, תאי NK), CD4 (תאי T), CD11b (גרנולוציטים; מונוציטים; מקרופגים), CD16 (תאי NK; מקרופגים; תאי פיטום), CD36 (טסיות דם), CD235a (תאי erythroid) כדי לרוקן את התאים שאינם B מדם חבל הטבור. חשוב להשתמש בערכה שתוארה ולא ב-צינוק הערכה השנייה כי הערכה לשעבר מכילה נוגדנים נגד CD43 אשר שוהים בתאים פרו-B. במהלך אופtimization של פרוטוקול זה, מצא כי סכום כולל של 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL הוא מספיק כדי לייצר תוצאת סוג תא חיובית. בנוסף מצאנו כי שימוש μl קטן כמו 5 יותר מקוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL היו השפעות שליליות על סוג התא. לכן, מומלץ מאוד להשתמש ב 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL למספרים סלולריים mononuclear כלל בין 175-250000000. אם מתחיל עם מספרים נמוכים יותר או גבוהים יותר של תאים ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ריאגנטים בהתאם.
יש פרסומים סותרים רבים המתארים את הסמנים שיכולים לשמש כדי להבדיל תת אוכלוסיות של תאי B. רוב הפער יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שבידול הוא תהליך מתמשך, וכי נוכחותו או היעדריו של סמנים בתא שטח מתרחשת באופן הדרגתי ולא באופן הכל או לא כלום. בפרוטוקול זה CD34 – / CD19 + ורמת האינטנסיביות של CD45 + (ביטוי נמוך, בינוני, גבוה) שמש להבחין מראש BI, B-תאים טרום BII ובוגרים עם עלייה ברמה של CD45 ביטוי מקביל להתקדמות של בידול 6. תאי Pro-B כבר תואר על ידי כמה להיות CD19 + / CD34 + 13 בעוד שאחרים הראו כי תאים פרו-B CD19 – / CD34 + ותאים טרום BI הם CD19 + / CD34 + 9,10. בהתבסס על פערים אלה יש לנו מיועדים לCD19 + / CD34 + תאים כמו תאים פרו-B מאוחרים / תאים מוקדמים מראש BI. חשוב לציין כי אסטרטגיה זו פותחה לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B המתאים לתאים המושפעים מלוקמיה לימפובלסטית המחלה החריפה. עם זאת, ישנן אסטרטגיות מיון מרובות שעשויה להיות מועסק בהתאם לתת סוג התא של עניין.
שילובי נוגדנים fluorochrome צריכים להיות נבחר על סמך היכולות של סדרן התא הזמין. כgeneraאני ככלל, fluorochrome הבהיר ביותר בלוח שלך יש להשתמש כדי לתייג את האנטיגן לפחות מאוכלס, ולהיפך. באיתור אוכלוסיות כפולות מוכתמות, במיוחד אירועים נדירים כגון אלה, אפלית כפיל (האיור 2B) היא חלק חשוב ביותר של אסטרטגית gating. הדבר מבטיח כי אירועים כפולים חיוביים הם באמת תאים בודדים מגואלים בשני נוגדנים ולא רק שני תאים בודדים מוכתמים דבקו זה לזה.
מהירות גבוהה, מיון תא 4-way בהכרח יוצרת סביבת אירוסול מבוקרת. לכן, מיון תא אנושי חי צריך להתבצע בזהירות רבה. פורסמו הנחיות בטיחות וטיהור זמינות ויש לבחון וליישם לפני הסוג 14. אישור מועדות biosafety מוסדיות או מקביליהם ייתכן שיידרש קודם למיון. לטיהור נאותה לאחר מיון, אקונומיקה, יש להוסיף למכל הפסולת לריכוז סופי של 10%. סיmilarly, כל צינורות דגימות, כמו גם את כל המשטחים בסביבה הקרובה יש לטהר ביסודיות עם 10% תמיסת כלור טרי.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה להשגת אוכלוסיות נדירות של מבשר תאי B וניתן לשנותו לבודד אוכלוסייה נוכחת בדם טבורים כוללים תאי גזע hematopoietic ובשל תאי T נדיר. לאחרונה, תאי B בשלים זוהו בדם ההיקפי של אנשים עם מתקדם 15-HIV. לפיכך, התועלת שבשיטה זו מאריכה מעבר למחקר של סרטן הדם. לבסוף, יש לנו עדיין לא בצעו בידודי RNA בתאים הממוינים הזרימה, אך שיטה זו צריכה להיות התאמה שיש לשים לב כי בתא מיון התאים אמורים להיות מיון ישירות לתוך trizol או פתרון תואם מקביל RNA כגון RLT מערכת RNeasy זמין דרך Qiagen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R00 CA132784) לKT
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature?. Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W. Fates of human B-cell precursors. Blood. 96 (1), 9-23 (2000).
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
