Rapid ensayos colorimétricos para distinguir cualitativamente ARN y ADN en muestras Biomolecular

Gran parte de la biología celular se produce a través de interacciones moleculares que interviene el ADN y el ARN. ⁴ Estos ácidos nucleicos de origen natural (AN) interactúan entre sí, con las proteínas, ⁵ y ⁶ con una serie de compuestos de pequeñas moléculas y ligandos in vivo (por ejemplo, cationes divalentes ^7). Las interacciones pueden ser de corta o de larga duración (cinéticamente), puede variar de alta a moderada a baja afinidad (fuerza termodinámica), y también pueden mostrar una variación sustancial en las propiedades químicas y la especificidad – algunas asociaciones son muy específicas (por ejemplo, ADN · · · los factores de transcripción, ARN · · · los factores de empalme), mientras que otras interacciones son necesariamente mucho más genérico (por ejemplo, el ADN · · · bacterianas histona-como las proteínas HU ^8). Interacciones no específicas con AN pueden tener consecuencias prácticas para los experimentos in vitro de mezclas de Biomolecules, ya que es posible, e incluso probable, que algunos AEs se asociará con las biomoléculas de interés, al menos en algún subconjunto de las condiciones experimentales que se utilizan (fuerza iónica, pH de la solución, etc.)

Consideremos, por ejemplo, la producción de una proteína de interés (POI) a través de la sobre expresión heteróloga de la proteína recombinante en cultivo de células de Escherichia coli; tal procedimiento se realiza rutinariamente en prácticamente cualquier laboratorio de biología estructural ⁹ En la preparación para experimentos adicionales, tales. como caracterización bioquímica / biofísica, cristalización, etc., los esfuerzos iniciales se centran generalmente en la obtención de una cantidad suficiente de la PDI en una forma tan pura como sea posible, idealmente como un espécimen químicamente homogénea y monodispersas biofísicamente. Después de la interrupción de las células huésped, las primeras etapas de purificación de un flujo de trabajo típico para aislar el objetivo de PDI de E. coli proteínas, ácidos nucleicos, restos de pared celular,y otros componentes del lisado celular. Sin embargo, host NAS puede co-purificar con el POI por varias razones fisicoquímicas – un PDI altamente básica puede no específicamente desplegable anfitrión de ADN / ARN, el POI puede tener un genérico NA actividad de unión (por ejemplo, el antes mencionado HU); el POI puede ser un bastante específico NA-proteína de unión, pero presentan reactividad cruzada con los ARN o ADN de acogida; anfitrión AN puede interactuar con una matriz de cromatografía y por lo tanto simplemente co-eluir con la PDI, y así sucesivamente. Indiscriminada, de alta afinidad de unión de anfitrión NAS a un POI puede plantear un problema molesto ya que las impurezas NA es probable que interferir con los experimentos posteriores (por ejemplo, ensayos de fluorescencia de anisotropía de POI unión • ARN ^10). Alternativamente, el PDI no anticipado · · · asociaciones NA también puede ser visto por casualidad, como tales interacciones iluminar el PDI ácido nucleico capacidad de unión. De cualquier manera, si AN son componentes claves o contaminantes, primero hay que cuantificar yidentificar el tipo (ADN, ARN) de AN co-purificación en preparación para experimentos posteriores.

Varios existen métodos analíticos para la detección y cuantificación de AN en una muestra. La mayoría de los métodos disponibles son fundamentalmente ya sea espectrofotométrico (por ejemplo, A ₂₆₀ y A valores de absorbancia ₂₆₀ / A ₂₈₀ coeficientes), fluorométrico (por ejemplo, la unión de tiazol naranja u otros colorantes fluorescentes a NA), o colorimétrico (susceptibilidad de nucleósidos para reacciones químicas que cromóforos absorbentes de rendimiento en la región UV-Vis del espectro electromagnético), como se describió recientemente por De Mey et al. ¹ Sin embargo, el paso crucial de identificar el tipo de polinucleótido como ARN o ADN está más allá del alcance de muchos de estos cuantificación enfoques. Aquí se proporciona un conjunto de ensayos colorimétricos para identificar rápidamente los tipos de componentes de NA en una muestra proteica.

Los protocolos descritos aquí cun ser ejecutados eficientemente sin etapas adicionales de aislamiento de las posibles impurezas de NA, y se basan en el ensayo de Benedict para azúcares reductores ^11, el ensayo de orcinol para pentosas ^{12,13, 14,15} y reacciones de difenilamina de 2'-deoxypentoses (Figuras 1 y 2) . Prueba de la Benedict (Figura 2a) utiliza la capacidad de la forma lineal, de cadena abierta (aldehído) de un azúcar aldosa para reducir Cu ^{2 +,} con la oxidación concomitante de carbonilo del azúcar a un resto carboxilato y producción de Cu ₂ O como un precipitado de color rojo insoluble. Esta reacción tendrá un resultado positivo con libres de azúcares reductores tales como aldosas y cetosas (que se convierten en las aldosas correspondientes a través de productos intermedios enediol), pero no con los azúcares de pentosa que están bloqueados en forma cíclica como parte del esqueleto covalente de un ADN o polinucleótido de ARN. Debido a la exigencia minimalista de una funcionalidad hemiacetal libre, co otrompounds que podrían dan positivo en este ensayo – y por lo tanto actuar como interferentes potenciales – incluyen α-hidroxi-cetonas y oligosacáridos cortos (por ejemplo, el disacárido maltosa). Tanto el de Bial orcinol (Figura 2b) y difenilamina Dische (Figura 2c), las reacciones se basan en la destrucción inicial de la columna vertebral de polinucleótido, a través de la despurinización del nucleósido y ácido-o adicionalmente catalizada por base hidrólisis de los nucleótidos matrices, para dar furano-2 -carbaldehído (furfural) derivados; estos derivados luego reaccionar ya sea con un polihidroxi fenol tal como orcinol (Bial) o difenilamina (Dische de) los reactivos para formar productos coloreados de condensación de estructura química en gran medida desconocido. El ADN frente a la especificidad de ARN de ensayo de la Dische se deriva del hecho de que el azúcar pentosa debe ser 2'-desoxigenado con el fin de ser susceptible a la oxidación a ω-hydroxylevulinyl aldehído, que además reacciona con difenilaminaen condiciones ácidas para producir un color azul brillante de condensado (Figura 2c). Utilizando los protocolos simplificados descritos aquí, se ha encontrado que estas reacciones colorimétricas específicas de azúcar puede diferenciar entre ARN y ADN, y también indican la presencia de azúcares libres reductores tales como glucosa, fructosa, ribosa o en una muestra biomolecular.