Summary

Rápidas de teste colorimétrico para Qualitativamente Distinguir RNA e DNA em amostras biomoleculares

Published: February 04, 2013
doi:

Summary

Um conjunto de ensaios colorimétricos é descrito para a proteína rapidamente distinguir, RNA, DNA, e re-dução de açúcares em amostras biomoleculares potencialmente heterogéneos.

Abstract

Experimentação Biochemical geralmente requer o conhecimento preciso, numa fase precoce, do ácido nucleico, proteínas, e outros componentes biomoleculares em espécimes potencialmente heterogéneos. Os ácidos nucleicos podem ser detectados através de várias abordagens estabelecidas, incluindo os métodos analíticos que são espectrofotométrica (por exemplo, A 260), fluorométrico (por exemplo, a ligação de corantes fluorescentes), ou colorimétrico (nucleósidos específicos de reacções químicas cromogénicos). 1 Ainda que não se pode distinguir facilmente RNA a partir de DNA, a A 260 / A 280 rácio é geralmente utilizado, uma vez que proporciona um método simples e rápido 2 Avaliação do teor relativo de ácido nucleico, que absorve predominantemente próximo de 260 nm e proteína, o qual absorve principalmente próximo de 280 nm. Coeficientes <0,8 são considerados como indicativos de "puras" amostras de proteína, enquanto que o ácido nucleico puro (NA) é caracterizada por taxas de> 1,5 3.

HoWever, há situações em que o conteúdo de proteína / NA não pode ser tão claramente ou de forma confiável inferida a partir de simples uv-vis medições espectrofotométricas. Por exemplo, (i) As amostras podem conter uma ou mais proteínas que são relativamente desprovida dos aminoácidos aromáticos responsáveis ​​pela absorção a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), como é o caso com algumas pequenas proteínas de ligação ao RNA e (ii) as amostras podem exibir intermédios A 260 / A 280 ratios (~ 0,8 <~ 1.5), onde o teor de proteínas / NA é muito menos clara e pode mesmo reflectir alguma afinidade elevada associação entre a proteína e os componentes de NA. Para tais situações, descrevemos aqui um conjunto de ensaios colorimétricos para distinguir rapidamente RNA, DNA e açúcares redutores, em uma amostra potencialmente misto de biomoléculas. Os métodos baseiam-se na sensibilidade diferencial de pentoses e outros hidratos de carbono para a Benedict, Bial (orcinol), e (difenilamina) Dische de reagentes, os protocolos podem ser simplificados comconcluída em questão de minutos, sem quaisquer passos adicionais de ter de isolar os componentes. Os ensaios podem ser realizados em paralelo, para diferenciar entre o RNA e de DNA, bem como indicar a presença de açúcares redutores livres tais como a glicose, frutose, ribose e (Figura 1).

Introduction

Grande parte da biologia das células ocorre através de interacções moleculares envolvendo DNA e RNA. 4 Estes ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente (AN) interagem uns com os outros, 5, 6, com as proteínas e com uma série de compostos de moléculas pequenas e ligandos in vivo (por exemplo, catiões divalentes 7). As interacções podem ser de curta ou de longa duração (cineticamente), pode variar desde moderada a alta para baixa afinidade (força termodinâmica), e também podem apresentar uma variação substancial nas propriedades químicas e especificidade – algumas associações são bastante específicas (por exemplo, DNA · · · fatores de transcrição, RNA · · · fatores de splicing), enquanto outras interações são necessariamente muito mais genérico (por exemplo, o DNA · · · bacterianas proteínas de histona-like HU 8). Não-específicas interações com AN pode ter consequências práticas para experimentos in vitro envolvendo misturas de biomolecules, uma vez que é possível, e mesmo provável, que alguns AEs vai associar com as biomoléculas de interesse, pelo menos em alguns subconjuntos de condições experimentais que está sendo usado (a força iónica, o pH da solução, etc.)

Considere-se, por exemplo, a produção de uma proteína de interesse (POI), através de sobre-expressão heteróloga da proteína recombinante em Escherichia coli da cultura de células; tal procedimento é realizado rotineiramente em virtualmente qualquer laboratório de biologia estrutural 9 Na preparação para experiências adicionais, tais. como caracterização bioquímica / biofísica, cristalização, etc., os esforços iniciais geralmente o foco sobre a obtenção de uma quantidade suficiente do PI em como uma forma pura quanto possível, de preferência como um espécime quimicamente homogéneo e biofísico monodisperso. Após a ruptura das células hospedeiras, os estágios iniciais de um fluxo de trabalho de purificação típico visam isolar o POI de E. proteínas de E. coli, ácidos nucleicos, fragmentos de paredes de células,e outros componentes do lisado celular. No entanto, o anfitrião AN pode co-purificar com o POI por várias razões fisico-químicas – um POI altamente básica pode não especificamente hospedeiro suspenso DNA / RNA, o POI pode ter uma actividade de ligação genérico NA (por exemplo, o HU acima mencionado); o POI pode ser um bastante específico proteína NA-ligação, mas exibem reactividade cruzada com RNAs hospedeiras ou DNAs; hospedeiro AN pode interagir com uma matriz de cromatografia e, assim, apenas co-eluir com o POI, e assim por diante. Indiscriminada, de alta afinidade de ligação do anfitrião AN a um PI pode representar um sério problema, porque as impurezas NA provavelmente vai interferir com os experimentos a jusante (por exemplo, ensaios de anisotropia de fluorescência de POI • RNA vinculativo 10). Alternativamente, POI imprevisto · · · NA associações também podem ser vistos por acaso, como tais interações iluminar a capacidade do POI de ligação de ácidos nucleicos. De qualquer maneira, se AN são componentes-chave ou contaminantes, deve-se primeiro quantificar eidentificar o tipo (DNA, RNA) de co-purificação AN em preparação para ensaios a jusante.

Diversos métodos analíticos para a detecção de existir e quantificando AN numa amostra. A maior parte dos métodos disponíveis são fundamentalmente ou espectrofotométrica (por exemplo, um 260 valores de absorvância e A 260 / A 280 rácios), fluorométrico (por exemplo, a ligação do tiazole de laranja ou de outros corantes fluorescentes para NA), ou colorimétrico (susceptibilidade de nucleósidos para as reacções químicas cromóforos que rendimento de absorção na região do UV-Vis do espectro electromagnético), tal como foi recentemente descrito por De Mey et al. 1 No entanto, o passo crucial de identificar o tipo de polinucleótido como RNA ou DNA está para além do alcance de muitos destes quantificação abordagens. Aqui nós fornecemos um conjunto de ensaios colorimétricos para rapidamente identificar os tipos de componentes de NA em uma amostra protéica.

Os protocolos aqui descritos cum ser eficientemente executados sem passos adicionais de isolar as impurezas potenciais de NA, e dependem do ensaio de Benedict para açúcares redutores 11, o ensaio de orcinol para pentoses 12,13, 14,15 e reacções difenilamina de 2'-deoxypentoses (Figuras 1 e 2) . O teste de Benedict (Figura 2a) utiliza a capacidade da forma linear, de cadeia aberta (aldeído) com um açúcar aldose para reduzir Cu 2 +, com a oxidação concomitante de carbonilo do açúcar a uma porção de carboxilato de metilo e de produção de Cu 2 O como um precipitado vermelho insolúvel. Esta reacção irá testar positivo com livre açúcares redutores tais como aldoses e cetoses (que converter as aldoses correspondentes, através de intermediários enediol), mas não com os açúcares pentose que estão bloqueados em forma cíclica, como parte do esqueleto covalente de um DNA ou RNA de polinucleótido. Devido à exigência de um minimalista funcionalidade hemiacetal livre, co outrompounds que poderia teste positivo neste ensaio – e, portanto, actuar como potenciais interferentes – incluem α-hidroxi-cetonas e oligossacarídeos curtos (por exemplo, a maltose dissacarídeo). Tanto do Bial orcinol (Figura 2b) e difenilamina Dische (Figura 2c), as reacções são baseados em destruição inicial da espinha dorsal de polinucleótidos, por despurinação do nucleósido e ácido-ou ainda catalisada por base a hidrólise dos nucleótidos mãe, para se obter furan-2 -carbaldeído (furfural) derivados; estes derivados reagem então com um fenol ou poli-hidroxi tais como orcinol (Bial) ou difenilamina (Dische de) os reagentes para formar produtos de condensação cor de estrutura química em grande parte desconhecida. O DNA versus ARN especificidade do ensaio do Dische decorre do facto de o açúcar pentose deve ser 2'-desoxigenada, a fim de ser susceptível à oxidação a ω-hydroxylevulinyl aldeído, o qual reage posteriormente com difenilaminasob condições ácidas, para se obter um condensado de azul brilhante (Figura 2c). Utilizando os protocolos descritos aqui simplificadas, verificou-se que estas reacções colorimétricas açúcar específicos podem diferenciar entre ARN e ADN, e também irá indicar a presença de açúcares redutores livres tais como a glicose, frutose, ribose, ou numa amostra biomolecular.

Protocol

1. Ensaio de Bento XVI para a Redução Açúcares Prepara-se uma quantidade adequada de reagente de Benedict – 940 mM de carbonato de sódio anidro, 588 mM de citrato de sódio desidratado, 68 mM de cobre penta-hidratado (II). Este reagente pode ser armazenada à temperatura ambiente (RT) durante pelo menos seis meses sem qualquer mudança notável na reactividade. O reagente acima é 6x. Assim, para 600 ul de reacções, adicionar 100 ul de reagente de Benedict para um tubo limpo de microcentrífu…

Representative Results

Os resultados são mostrados na Figura 3 para a aplicação destes ensaios colorimétricos para os compostos de referência conhecidos. Representativos dos dados qualitativos são mostradas para (a) a Benedict, Bial de orcinol (b), e Dische de difenilamina (c) ensaios, e as curvas-padrão para estes três ensaios estão apresentados na Figura 4. Em painéis 3 (ac), os painéis da esquerda mostram as experiências positivas / negativas de controlo utilizando analitos adequadamente reacti…

Discussion

Os ensaios colorimétricos aqui apresentados oferecem uma abordagem simples para avaliar rapidamente a natureza química das misturas biomoleculares, tais como os que são encontrados quando a purificação de proteínas, RNAs ou complexos de lisado de células inteiras, em preparação para estudos posteriores. Como biologia estrutural prossegue montagens mais semelhante à nativa, desafios progressivamente maiores, tais como a heterogeneidade da amostra, serão colocados pelos complexos intrincados e multi-compo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pela Universidade da Virgínia e da Jeffress Memorial Trust (J-971). Agradecemos a L. Columbus, K. Jain, e P. Randolph para discussões úteis e leitura crítica do manuscrito.

Materials

Reagent or equipment Supplier/company Catalog number Comments, notes
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263  
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641  
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2  
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875  
Concentrated HCl VWR BDH3030  
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877  
Diphenylamine Aldrich 112763  
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28  
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105  
Ethanol Koptec V1101  
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
     

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

References

  1. De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
  2. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  3. Ausubel, F. M. . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).
  4. Voet, D., Voet, J. G. . Biochemistry. , (2011).
  5. Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. . The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).
  6. Rice, P. A., Correll, C. C. . Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).
  7. Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).
  8. Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
  10. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  11. Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
  12. Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
  13. Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
  14. Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
  15. Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
  16. Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
  17. Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
  18. Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
  19. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).
  20. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).

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Cite This Article
Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

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