Быстрое колориметрических тестов на качественно Различают РНК и ДНК в биомолекулярных образцов
Summary
Набор колориметрических тестов описан быстро отличительной белков, РНК, ДНК, и вновь ducing сахара в потенциально гетерогенных образцов биомолекул.
Abstract
Биохимические эксперименты как правило, требует точного знания, на ранней стадии, в состав нуклеиновых кислот, белков и других компонентов биомолекулярной в потенциально гетерогенных образцов. Нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены через несколько устоявшиеся подходы, включая аналитические методы, которые спектрофотометрического (например, 260), флуорометрической (например, связывания флуоресцентных красителей), или колориметрическим (нуклеозид конкретных хромогенных химических реакций). 1 Хотя это не легко отличить РНК от ДНК, 260 / A 280 отношение обычно используется, так как она предлагает простой и быстрый 2 Оценка относительного содержания нуклеиновых кислот, которые поглощают преимущественно вблизи 260 нм и протеина, который поглощает в основном вблизи 280 нм. Коэффициенты <0,8 принимаются как показатель «чистые» образцы белка, в то время как чистая нуклеиновой кислоты (NA) характеризуется отношение> 1,5 3.
HoWever, существуют сценарии, в которых белок / NA содержание не может быть столь же четко и надежно вывести из простого UV-VIS спектрофотометрического измерения. Например, (я) образцы могут содержать один или несколько белков, которые являются относительно лишенной ароматические аминокислоты отвечают за поглощение при ≈ 280 нм (Trp, Tyr, Phe), как и в случае с некоторыми малыми РНК-связывающие белки, и (II), образцы могут проявлять промежуточные A 260 / A 280 соотношения (~ 0.8 <~ 1.5), где белок / NA содержание гораздо менее ясен и даже может отражать некоторые высоким сродством связь между белком и Н. А. компонентов. Для такого сценария, мы опишем здесь набор колориметрические анализы быстро отличать РНК, ДНК, и снижение сахара в потенциально смешанного образца биомолекул. Методы опираются на различную чувствительность пентоз и других углеводов, чтобы Бенедикта, Bial (в орцинола), и Дише (в дифениламина) реагентов; обтекаемой протоколов может быть комзавершена в течение нескольких минут, без каких-либо дополнительных шагов от того, чтобы изолировать компоненты. Анализы могут выполняться параллельно проводить различие между ДНК и РНК, а также указывают на наличие свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза и (рис. 1).
Introduction
Большая часть клеточной биологии происходит через молекулярные взаимодействия с участием ДНК и РНК. 4 Эти естественные нуклеиновых кислот (НО) взаимодействуют друг с другом, 5 с белками, 6 и с множеством малых молекул соединений и лигандов в естественных условиях (например, двухвалентных катионов 7). Взаимодействия могут быть кратко-или долгосрочных (кинетически), могут варьироваться от умеренных до высоких к низким сродством (термодинамические силы), а также может обладать существенным изменением химических свойств и специфики – некоторые ассоциации являются достаточно специфическими (например, ДНК · · факторы транскрипции, РНК · · · факторы сплайсинга), в то время как другие взаимодействия обязательно являются гораздо более общие (например, ДНК · · · бактериальный гистона-подобных белков HU 8). Non-специфическими взаимодействиями с НСБУ может иметь практические последствия для лабораторного эксперимента с участием смесей biomolecules, как это возможно, и даже вероятно, что некоторые ВПЛ будут ассоциировать с биомолекул интерес, по крайней мере в некоторое подмножество экспериментальных условиях используются (ионной силы, рН раствора и т.д.).
Рассмотрим, например, производство белка интереса (POI) через гетерологичных чрезмерной экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia культуре клеток кишечной; такая процедура обычно выполняется практически в любой лаборатории структурной биологии 9 В подготовкой для дальнейших экспериментов, например. как биохимическая / биофизических характеристик, кристаллизация, и т.д.., первоначальные усилия правило, сосредоточены на получении достаточного количества POI в качестве чистой, по возможности, идеально, как химически однородной и биофизически монодисперсных образцов. После разрушения клеток-хозяев, на ранних стадиях типичный рабочий процесс очистки стремиться изолировать POI из E. палочки белков, нуклеиновых кислот, мусор клеточной стенки,и другие компоненты клеточных лизатов. Тем не менее, хозяин NAS может совместно очищают с POI в течение нескольких физико-химических причин – очень основной POI могут неспецифически выпадающего хозяин ДНК / РНК; POI могут иметь общие NA-связывающей активности (например, вышеупомянутый HU); POI может быть достаточно конкретным NA-связывающего белка, но экспонат перекрестной реактивности с принимающей РНК или ДНК, принимающих NAS может взаимодействовать с матрицей хроматографии и тем самым просто совместно элюируются с POI, и так далее. Неизбирательное, высокое сродство связывания хозяин NAs к POI могут представлять неприятная проблема, потому что НС примесей, скорее всего, мешают вниз по течению экспериментов (например, анализы флуоресценции анизотропии POI • связывание РНК 10). Кроме того, непредвиденные POI · · · НС ассоциации также могут быть просмотрены случайно, так как такое взаимодействие освещения нуклеиновой кислоты связывающей способности POI автора. В любом случае, независимо от того НАН Украины являются ключевыми компонентами или загрязняющих веществ, нужно сначала количественно иопределить тип (ДНК, РНК) совместной очистки НАН Украины в подготовке к вниз по течению экспериментов.
Некоторые аналитические методы для обнаружения и количественного НАН Украины в образце. Большинство из доступных методов принципиально либо спектрофотометрический (например, A 260 значения абсорбции и 260 / A 280 коэффициентов), флуорометрической (например, связывание тиазола оранжевого или других флуоресцентных красителей НС), или колориметрическим (восприимчивость нуклеозидов в химических реакциях что выход хромофоров поглощающие в УФ-VIS области электромагнитного спектра), а недавно описаны де Мей и др. 1. Тем не менее, важным шагом в определении типа полинуклеотид как РНК или ДНК, выходят за рамки многих из этих количественного подходы. Здесь мы предлагаем набор колориметрических тестов для быстрого выявления типов компонентов НС в белковой образца.
Протоколов, описанных здесь сбыть эффективно выполнены без дополнительных мер изоляции потенциальных примесей NA, и полагаться на анализ Бенедикта для снижения сахара 11, орцинола анализа для пентоз 12,13 и 14,15 реакции дифениламина 2'-deoxypentoses (рис. 1 и 2) . Тест Бенедикт (рис. 2а) использует способность линейной, открытой цепью (альдегид) форма альдозы сахара снизить Cu 2 +, с сопутствующей окисление карбонильных сахара в карбоксилат фрагмент и производства Cu 2 O в качестве нерастворимого красного осадка. Эта реакция будет положительной реакцией с бесплатным снижения сахара, такие как альдоз и кетоз (которые преобразуют в соответствующие альдоз через enediol промежуточные продукты), но не с пентозы сахара, которые зафиксированы в циклической форме, как часть ковалентной основу ДНК или РНК полинуклеотида. В связи с минималистичным требование свободного полуацеталь функциональность, другие сотрудничествеmpounds, которые могли бы положительный результат в этом тесте – и, следовательно, выступать в качестве потенциальных мешающих – включают α-гидрокси-кетоны и коротких олигосахаридов (например, дисахарид мальтозу). И Bial в орцинола (рис. 2б) и Дише в дифениламина (рис. 2, в) реакции основаны на начальном разрушение полинуклеотида позвоночника, через депуринизации нуклеозида и дальнейшего кислоты или основания катализируемого гидролиза родителей нуклеотида, с получением фуран-2 -карбальдегида (фурфурол) производные; эти производные затем реагировать либо с полигидрокси фенола, такие как орцинола (Bial) или дифениламина (Дише автора) реагентами с образованием окрашенных продуктов конденсации в значительной степени неизвестной химической структуры. ДНК по сравнению с РНК специфика анализа Дише проистекает из того факта, что пентозы сахара должно быть 2'-венозная для того, чтобы быть восприимчивым к окислению ω-hydroxylevulinyl альдегид, который далее реагирует с дифениламинав кислых условиях с получением ярко-синий конденсата (рис. 2). Использование обтекаемой протоколов, описанных здесь, мы обнаружили, что эти сахара конкретных колориметрических реакций могут дифференцироваться между РНК и ДНК, а также будет свидетельствовать о наличии свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза или в молекулярно-биологических образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Колориметрических тестов, представленные здесь предлагают простой подход к быстрой оценки химической природы биомолекулярных смесей, таких как встречаются при очистке белков, РНК или комплексы из цельного клеточный лизат в подготовке для дальнейших исследований. Как структурной…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась в университете Вирджинии и Джеффресс Memorial Trust (J-971). Мы благодарим Л. Columbus, K. Jain, П. Randolph за полезные обсуждения и критического чтения рукописи.
Materials
| Reagent or equipment | Supplier/company | Catalog number | Comments, notes |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
|
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
References
- De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Ausubel, F. M. . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).
- Voet, D., Voet, J. G. . Biochemistry. , (2011).
- Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. . The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).
- Rice, P. A., Correll, C. C. . Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).
- Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).
- Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
- Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
- Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
- Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
- Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
- Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
- Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
- Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
