定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ
Summary
比色アッセイのスイートが急速に区別するタンパク質、RNA、DNA、および潜在的に異種生体試料中の再ducing糖に記載されている。
Abstract
生化学的な実験は、一般的に潜在的に異種の標本で正確な核酸の初期段階での知識、、、タンパク質、その他の生体分子のコンポーネントを必要とします。核酸は、それは容易に区別することはできませんが（ 例えば 、260）、蛍光（ 例えば 、蛍光色素の結合）、または比色（ヌクレオシド特有の発色の化学反応）。1光度アール分析方法など、いくつかの確立されたアプローチを介して検出することができますそれは280 nm付近で主に吸収260nmおよびタンパク質近く主に吸収する核酸、の相対量の簡便かつ迅速な2アセスメントを提供しているので、DNAからRNAが、260/280比は、一般的に採用されている。 1.5 3比<純粋な核酸（NA）の比によって特徴付けられる一方0.8は、 "純粋な"タンパク質試料の指標として採用されています>。
ホーwever、タンパク質/ NAのコンテンツがあると明確に、または確実に単純なUV-VIS分光光度測定から推測できないようなシナリオがあります。いくつかの小さなRNA結合タンパク質の場合と同様、例えば、（i）のサンプルは、≈280 nmの（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）の吸収を担当する芳香族アミノ酸の相対的に欠いている1つ以上のタンパク質が含まれていたり、 （ⅱ）サンプルはタンパク質/ NA含有量ははるかに少ない明らかであり、さらにタンパク質とNAコンポーネント間のいくつかの高親和性の関連性を反映している可能性がある中間の260 / A 280比（〜0.8 <〜1.5）を、示すことができる。このようなシナリオのために、私たちは急速に生体分子の潜在的混合試料中のRNA、DNA、および還元糖を区別するための比色アッセイの本明細書中にスイートを記述します。方法はベネディクトの、Bial社の（オルシノール）、およびDischeの（ジフェニルアミン）試薬にペントースおよび他の炭水化物の感受性差に依存して、合理化されたプロトコルは、comできるコンポーネントを分離することのいずれかの追加手順なしで、ほんの数分で竣工。アッセイは、RNAとDNAの区別だけでなく、例えば、グルコース、フルクトース、リボース（ 図1）のようなフリーの還元糖の存在を示すために並行して行うことができる。
Introduction
多くの細胞生物学では、DNAとRNAが関与する分子間相互作用を介して行われます。4これらの天然に存在する核酸（NAS）（ 例えば 、二価カチオンタンパク質、6とし、in vivoでの小分子化合物とリガンドのホストと、互いに5対話7）。相互作用は（動力学的に）短期または長命かもしれ範囲高から低親和性（熱力学的強度）に中等度の場合があり、また化学的性質や特異性の大幅な変動を示すことができます-いくつかの団体は、非常に特異的である（ 例えば 、DNA· ··転写因子は、RNA···スプライシング因子）、他の相互作用は、必ずしも、はるかに一般的な（ 例えば 、DNA···細菌のヒストン様蛋白質HU 8）している間。 NASとの非特異的な相互作用はbiomoの混合物を含むin vitro実験のための実用的な結果をもたらす可能性があるlecules、それはいくつかのNASは、少なくとも使用されている実験条件のいくつかのサブセット（イオン強度、溶液のpH、 等 ）で、目的の生体分子に関連付けることが可能で、さらにそうであるように。
大腸菌細胞培養における組換えタンパク質の異種過剰発現を介して 、例えば、利息（ポイ）のタンパク質の産生を考慮して、そのような手順は、日常的に実質的に任意の構造生物学の研究室で行われる9さらなる実験のための準備では、そのような。生化学/生物物理学的特性、結晶化などのように、初期の取り組みは、一般的に理想的に化学的に均質と生物物理学的に単分散の標本として、できるだけ純粋な形としてPOIの十分な量を得ることに焦点を当てる。宿主細胞の破壊の後、代表的な浄化ワークフローの初期段階では、EからPOIを隔離することを目指して大腸菌タンパク質、核酸、細胞壁の破片、細胞溶解物のおよびその他のコンポーネント。ただし、ホストNASはいくつかの物理化学的な理由のためにポイと共精製することができる-非常に基本的なPOIが非特異プルダウン宿主DNA / RNAのかもしれません。POIは（ 例えば 、前述のHU）ジェネリックNA-結合活性を持つことができます。 POIは、宿主のRNAまたはDNAでかなり特定のNA-結合タンパク質が、展示物の交差反応性であってもよく、ホストNASはPOIにクロマトグラフィーマトリックスと相互作用し、それによって、単に共溶出ができるように続きます。 NAの不純物はおそらく下流の実験（ 例えば 、POI•RNA結合10の蛍光異方性アッセイ）を妨害する可能性がありますので、POIにホストNAの見境のない、高親和性結合は厄介な問題を提起することができます。このような相互作用は、POIの核酸結合能を照らす別の方法として、予期せぬPOIが···NAの関連付けも、偶発的に閲覧することができます。どちらにしても、NASはキーコンポーネントや汚染物質であるかどうか、片方が最初に定量化しなければなりません下流の実験の準備のために共同浄化NAのタイプ（DNA、RNA）を識別します。
いくつかの分析法の検出とサンプルでNASを定量するために存在しています。利用可能なメソッドのほとんどは、（基本的にはどちらか（ 例えば 、チアゾールオレンジまたはNAに他の蛍光色素の結合）蛍光（ 例えば 、260の吸光度値と260 / A 280比）分光光度、または比色アール化学反応へのヌクレオシドの感受性しかし、RNAまたはDNAのポリヌクレオチドの種類を識別するための重要なステップは、これらの定量の多くの範囲を超えて、電磁スペクトルの紫外-可視領域で吸収降伏発色団）が、、最近ドゥ·メイらによって記載され、図1アプローチ。ここでは、急速にタンパク質性のサンプルにはNAコンポーネントの種類を識別するための比色アッセイのセットを提供します。
プロトコルは、ここでcを説明効率的に潜在的なNAの不純物を分離する追加のステップなしで実行され、糖質11を減少させるためのベネディクトのアッセイに依存し、2'-deoxypentosesのペントース12,13及びジフェニルアミン反応14,15（ 図1および図2）オルシノール検定さ。ベネディクトのテスト（ 図2a）は、アルドース糖の形として砂糖のカルボニルの付随酸化によるCu 2 Oのカルボン酸部分と生産にCu 2 +を 、減少させるために、線形、開鎖（アルデヒド）の能力を活用不溶性の赤色沈殿。この反応は、アルドースやケトースのようなフリーの還元糖（エンジオール中間体を介して対応するアルドースに変換する）とではなく、DNAまたはRNAポリヌクレオチドの共有バックボーンの一部として循環形式にロックされペントース糖と陽性になります。無料のヘミアセタール機能のミニマル要件、他の共有者のためしたがって、潜在的な妨害物として働く- -このアッセイで陽性でしたmpoundsは、α-ヒドロキシケトンおよび短いオリゴ糖（ 例えば二糖マルトース）が含まれています。両方Bial社のオルシノール（ 図2b）とDischeのジフェニルアミン（ 図2c）の反応は、ポリヌクレオチド鎖の最初の破壊に基づくものであり、ヌクレオシドの脱プリン反応、さらに酸または親ヌクレオチドの塩基触媒による加水分解を経て、フラン-2を得るためにカルボアルデヒド（ フルフラール ）誘導体;これらのデリバティブは、そのようなオルシノール（Bial社の）またはジフェニルアミン（Discheの）大部分は未知の化学構造の着色された縮合生成物を形成するための試薬 としてフェノールどちらヒドロキシと反応する。 DischeのアッセイのRNA特異対DNAは五炭糖がさらにジフェニルアミンと反応して、ω-hydroxylevulinylアルデヒドに酸化されやすいようにするために、2'-脱酸素化でなければならないという事実から生じ酸性条件下で明るい青コンデンセート（ 図2c）を得た。ここで説明する合理化されたプロトコルを使用して、我々はこれらの糖特異的比色反応はRNAとDNAとを区別することができ、また、そのような生体分子試料中のグルコース、フルクトース、またはリボースなどのフリー還元糖の存在を示すことに気づいています。
Protocol
Representative Results
Discussion
比色アッセイは、急速にそのようなさらなる研究のための準備として、全細胞溶解物からのタンパク質、RNAまたは複合体を精製する際に遭遇するなどの生体分子の混合物の化学的性質を評価するためのシンプルなアプローチを提供するここに提示した。構造生物学は、このような試料の不均一性など、よりネイティブライクなアセンブリ、徐々に大きな課題を追求したように、複雑で多?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、バージニア大学とJeffress記念信託（J-971）によって賄われていた。我々は有用な議論と原稿の批判的な読みに対して、L.コロンバス、K. Jainさん、およびP.ランドルフに感謝します。
Materials
| Reagent or equipment | Supplier/company | Catalog number | Comments, notes |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
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Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
References
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