Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben
Summary
Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.
Abstract
Biochemischer Experimente in der Regel erfordert genaue Kenntnisse, in einem frühen Stadium, der Nukleinsäure, Protein und anderen biomolekularen Komponenten in potentiell heterogenen Proben. Nukleinsäuren können über mehrere etablierte Methoden, einschließlich analytischen Methoden, die spektrophotometrische sind (z. B. A 260), fluorometrische (z. B. die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffe) oder farbmetrisch (Nukleosid-spezifischen chromogenen chemische Reaktionen). 1 Obwohl es nicht leicht unterscheiden kann erkannt werden RNA aus DNA, das A 260 / A 280-Verhältnis wird üblicherweise verwendet, da sie einen einfachen und schnellen 2 Beurteilung der relative Gehalt an Nukleinsäure, die überwiegend in der Nähe 260 nm absorbiert und Protein, das hauptsächlich in der Nähe 280 nm absorbiert bietet. Ratios <0,8 werden als Indikator für die "reinen" Protein Proben entnommen, während reine Nukleinsäure (NA) durch Verhältnisse gekennzeichnet ist> 1,5 3.
However, gibt es Situationen, in denen das Protein / NA Gehalt nicht deutlich oder können als zuverlässig abgeleitet von einfachen UV-VIS spektrophotometrische Messungen. Zum Beispiel werden (i) Proben können ein oder mehrere Proteine, die relativ frei von den aromatischen Aminosäuren, die für Absorption bei ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) sind, wie es der Fall mit einigen kleinen RNA-bindenden Proteinen und (ii) Proben weisen Zwischenprodukt A 260 / A 280-Verhältnisse (~ 0,8 <~ 1,5), wo das Protein / NA Inhalt ist weit weniger klar und kann sogar auf eine gewisse hoher Affinität Zusammenhang zwischen dem Protein und NA-Komponenten. Für derartige Szenarien beschreiben wir hier eine Reihe von kolorimetrischen Assays rasch unterscheiden RNA, DNA und reduzierende Zucker in einer potentiell Mischprobe von Biomolekülen. Die Methoden beruhen auf der Differenz Empfindlichkeit der Pentosen und andere Kohlenhydrate Benedikt, Bial (Orcin) und Disches (Diphenylamin) Reagenzien, die gestrafft Protokolle com seinabgeschlossen innerhalb weniger Minuten, ohne irgendwelche zusätzlichen Schritte aufweist, um die Komponenten zu isolieren. Die Assays können parallel durchgeführt werden, um zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, sowie die Anwesenheit von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Ribose und (Abbildung 1).
Introduction
Ein Großteil der Zellbiologie erfolgt über molekulare Wechselwirkungen zwischen DNA und RNA. 4 Diese natürlich vorkommenden Nukleinsäuren (NA) miteinander zusammenwirken, 5 mit Proteinen, 6 und mit einer Vielzahl von niedermolekularen Verbindungen und Liganden in vivo (zB divalente Kationen 7). Die Wechselwirkungen können kurz-oder langlebig (kinetisch), können von hohen Bereich zu geringe Affinität (thermodynamische Kraft) moderieren und können zeigen auch erhebliche Unterschiede in den chemischen Eigenschaften und Spezifität – einige Verbände sind recht spezifisch (zB DNA · · · Transkriptionsfaktoren, RNA · · · Spleißfaktoren), während andere Kommunikationen notwendigerweise weit mehr generische (zB DNA · · · bakteriellen histonähnliche HU-Proteine 8). Nicht-spezifische Interaktionen mit NAs können praktische Konsequenzen für in vitro Experimente mit Mischungen von biomolecules, da es möglich und sogar wahrscheinlich ist, dass einige NAs wird mit den Biomoleküle von Interesse zu verbinden, zumindest unter gewissen Teilmenge der experimentellen Bedingungen verwendet wird (Ionenstärke, pH usw.).
Betrachten wir zum Beispiel Herstellung eines Proteins von Interesse (POI) über heterologe Überexpression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli Zellkultur; solches Verfahren wird routinemäßig in praktisch jedem strukturellen Biologielabor durchgeführt 9 In Vorbereitung für weitere Experimente, wie. Als biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung, Kristallisation, etc., anfänglichen Bemühungen in der Regel auf die Erzielung einer ausreichenden Menge des POI konzentrieren möglichst reiner Form wie möglich, idealerweise als chemisch homogen und biophysikalisch monodisperse Probe. Nach dem Aufbrechen der Wirtszellen, zielen die frühen Phasen eines typischen Aufreinigung Workflow, um den POI aus E. isolieren coli-Proteine, Nukleinsäuren, Zellwandtrümmern,und andere Komponenten des zellulären Lysat. Jedoch Host NAs kann mit dem POI mehrere physikochemische Gründen co-läutern – ein hochbasisches POI kann unspezifisch Pulldown-Wirts-DNA / RNA, die POI kann ein generisches NA-bindende Aktivität aufweisen (zB die oben erwähnten HU); das POI kann eine ziemlich spezifische NA-Bindungsprotein sondern zeigen Kreuzreaktivität mit Host-RNAs oder DNAs sein; Host NAs kann mit einer Chromatographiematrix wechselwirken und dadurch einfach koeluieren mit dem POI, und so weiter. Willkürliche, hoch-affine Bindung von Host NAs zu einem POI können stellen eine ärgerliche Problem, weil die NA Verunreinigungen wird wahrscheinlich mit nachgeschalteten Experimente (zB Fluoreszenzanisotropie Assays POI • RNA-Bindung 10) stören. Alternativ unerwartete POI · · · NA Verbände können auch zufällig angesehen werden, wie solche Wechselwirkungen beleuchten die POI-Nukleinsäure-bindende Kapazität. So oder so, ob NAs wichtigen Komponenten oder Verunreinigungen sind, muss man zunächst quantifizieren undBestimmung der Art (DNA, RNA) von Co-Reinigungskatalysator NAs in Vorbereitung für nachfolgende Versuche.
Mehrere analytischen Methoden existieren zur Detektion und Quantifizierung von NA in einer Probe. Die meisten der verfügbaren Methoden sind grundsätzlich entweder spektrophotometrischen (z. B. A 260 Extinktionswerte und A 260 / A 280-Verhältnisse), fluorometrische (z. B. die Bindung von Thiazolorange oder andere fluoreszierende Farbstoffe auf NA) oder farbmetrisch (Suszeptibilität von Nukleosiden, um chemische Reaktionen Ausbeute daß Chromophore absorbierend im UV-VIS-Bereich des elektromagnetischen Spektrums), wie kürzlich von De Mey et al. 1 Jedoch ist der entscheidende Schritt des Identifizieren des Typs des Polynukleotid, wie RNA oder DNA über den Rahmen viele dieser Quantifizierung Ansätze. Hier bieten wir einen Satz von kolorimetrischen Assays für die schnelle Erkennung der Arten von NA-Komponenten in einem proteinhaltigen Probe.
Die hier beschriebenen Protokolle ceine effizient ohne zusätzlichen Schritte der Isolierung der potentiellen NA Verunreinigungen ausgeführt werden, und sich auf Benedikts Assay für reduzierende Zucker 11, das Orcinol-Assay für Pentosen 12,13, 14,15 und Diphenylamin Reaktionen von 2'-deoxypentoses (Abbildungen 1 und 2) . Die Benedikts Test (2a) nutzt die Fähigkeit der linearen, offenkettige (Aldehyd)-Form einer Aldose Zucker zu Cu 2 +, unter Oxidation des Zuckers Carbonylgruppe zu einer Carboxylat-Komponente und Produktion von Cu 2 O als eine Reduzierung unlöslichen roten Niederschlag. Diese Reaktion testen mit freien reduzierenden Zuckern wie Aldosen und Ketosen (die mit den entsprechenden Aldosen über Endiol Zwischenprodukte umzuwandeln) positive, aber nicht mit Pentosezucker, dass in zyklischer Form als Teil der kovalenten Rückgrat eines DNA-oder RNA-Polynukleotid gesperrt. Aufgrund des minimalistischen Erfordernis einer freien Halbacetal Funktionalität, andere Compounds, die positiv getestet werden in diesem Test konnte – und wirken somit als potenzielle Störfaktoren – gehören α-Hydroxy-Ketone und kurze Oligosaccharide (zB das Disaccharid Maltose). Sowohl die Bial Orcin (Abbildung 2b) und Disches Diphenylamin (Abbildung 2c) Reaktionen werden bei der erstmaligen Zerstörung des Polynukleotid Backbone, über Depurinierung der Nukleosid-und weitere Säure-oder Basen-katalysierten Hydrolyse der Muttergesellschaft Nukleotide, die Furan-2 ergeben -carbaldehyd (Furfural) Derivate; diese Derivate reagieren dann entweder mit einem Polyhydroxyphenol wie Orcin (Bial) oder Diphenylamin (Disches) Reagenzien, farbige Kondensationsprodukte von weitgehend unbekannten chemischen Struktur zu bilden. Die DNA im Vergleich zu RNA-Spezifität des Disches Assay beruht auf der Tatsache, daß der Pentosezucker muss 2'-desoxygenierten, um es zu Störungen durch Oxidation zu ω-hydroxylevulinyl Aldehyd, das weiter reagiert mit Diphenylaminunter sauren Bedingungen unter Bildung eines hellblauen Kondensat (Abbildung 2c). Mit den hier beschriebenen Protokolle gestrafft haben wir gefunden, dass diese zuckerfreie spezifischen kolorimetrischen Reaktionen können zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, und wird auch auf das Vorhandensein von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose oder Ribose in einer biomolekularen Probe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kolorimetrische Assays hier vorgestellten bieten eine einfache Ansatz rasch beurteilt die chemische Natur der biomolekularen Mischungen, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Reinigung von Proteinen, RNAs oder-Komplexen aus Ganzzellen-Lysat in Vorbereitung für weitere Studien. Als Strukturbiologie verfolgt mehr native-like Baugruppen zunehmend größeren Herausforderungen wie Probe Heterogenität wird durch die komplizierte und Mehrkomponenten-Komplexen gestellt werden. Supramolekularen Aggregate sind oft nu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der University of Virginia und der Jeffress Memorial Trust (J-971) finanziert. Wir danken L. Columbus, K. Jain, und P. Randolph für hilfreiche Diskussionen und die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Reagent or equipment | Supplier/company | Catalog number | Comments, notes |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
|
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
References
- De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Ausubel, F. M. . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).
- Voet, D., Voet, J. G. . Biochemistry. , (2011).
- Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. . The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).
- Rice, P. A., Correll, C. C. . Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).
- Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).
- Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
- Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
- Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
- Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
- Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
- Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
- Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
- Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
