מבחני colorimetric מהירים לאופן איכותי להבחין RNA ו-DNA בדגימות biomolecular
Summary
חבילה של מבחני colorimetric מתוארת לחלבון במהירות הבחנה, רנ"א, דנ"א, וסוכרים מחדש ducing בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות.
Abstract
ניסויים ביוכימיים בדרך כלל דורשים ידע מדויק, בשלב מוקדם, של חומצות הגרעין, חלבונים ומרכיבים אחרים בדגימות biomolecular פוטנציאלי הטרוגניות. חומצות גרעין ניתן לאתר באמצעות כמה גישות הוקמו, כולל שיטות אנליטיות שspectrophotometric (למשל, 260), fluorometric (למשל, כריכה של צבעי ניאון), או colorimetric (תגובות כימיות chromogenic nucleoside ספציפיים). 1 למרות שאנחנו לא יכולים להבחין RNA מ-DNA, 260/280 יחס מועסק בדרך כלל, כפי שהוא מציע 2 הערכה פשוטה ומהירה של התוכן היחסי של חומצות גרעין, אשר סופגות בעיקר ליד 260 ננומטר וחלבונים, אשר סופגים בעיקר ליד 280 ננומטר. יחסים <0.8 נלקחים כמצביעות על דגימות חלבון "טהורות", ואילו חומצת גרעין טהורה (NA) מאופיינת ביחסים> 1.5 3.
הוwever, יש תרחישים שבם תכולת החלבון / אנ לא יכולה להיות ברורה או מהימן להסיק ממדידות spectrophotometric UV-VIS פשוטות. לדוגמה, (אני) דגימות עשויות להכיל חלבונים אחד או יותר שהם יחסית נטולי החומצות האמינו ארומטיים האחראיות על ספיגה ב≈ 280 ננומטר (TRP, Tyr, Phe), כפי שקורה עם כמה חלבונים קטנים RNA-מחייבים, ו (Ii) דוגמאות ניתן להציג ביניים A 260 / A 280 יחסים (~ 0.8 <~ 1.5), שבו תכולת החלבון / NA הרבה פחות ברור, ואף עלול משקפות חלק-זיקה גבוה קשר בין מרכיבי החלבון ואנ. לתרחישים כאלה, נתאר להלן חבילה של מבחני colorimetric מהירות להבחין RNA, DNA, והפחתת סוכרים במדגם פוטנציאלי מעורב של ביומולקולות. השיטות להסתמך על רגישות ההפרש של pentoses ופחמימות אחרות לבנדיקט, יאל של (orcinol), והמגיבים של Dische (diphenylamine); הפרוטוקולים היעילים יכול להיות completed בעניין של דקות, ללא כל פעולה נוספת שיש לבודד את הרכיבים. את המבחנים ניתן לבצע במקביל להבחנה בין רנ"א ודנ"א, כמו גם להעיד על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, וריבוז (1 איור).
Introduction
הרבה מביולוגיה של תא מתרחשות באמצעות אינטראקציות מולקולריות המעורבות DNA ו-RNA. 4 חומצות גרעין באופן טבעי אלה (NAS) אינטראקציה זה עם זה, 5, 6 עם חלבונים ועם שורה של תרכובות מולקולה קטנה וligands in vivo (למשל, קטיונים divalent 7). האינטראקציות עשויות להיות קצרים או ארוך חיים (ודינג), עשוי לנוע בין גבוה עד בינוני לזיקה נמוכה (כוח התרמודינמית), וגם יכול להציג וריאציה משמעותית בתכונות כימיות וסגולית – כמה עמותות הן ספציפיות (למשל, ה-DNA · · גורמי תעתוק, RNA · · · גורמי שחבור), ואילו אינטראקציות אחרות הן בהכרח הרבה יותר כללי (למשל, ה-DNA · · · חלבונים חיידקיים היסטון דמויים הו 8). אינטראקציות לא ספציפיות עם NAS יכולות להיות השלכות מעשיות לניסויים במבחנה מעורבת תערובות של biomolecules, כפי שזה אפשרי, בסבירות גבוהה, כי חלק NAS יקשר עם ביומולקולות של עניין, לפחות תחת משנה חלק מתנאי הניסוי בשימוש (חוזק יוני, pH פתרון, וכו ').
קח, לדוגמה, ייצור של חלבון של עניין (POI) באמצעות ביטוי יתר של חלבון Heterologous רקומביננטי בתרבית תאי חיידקי Escherichia; הליך כזה מבוצע באופן שגרתי כמעט בכל מעבדת ביולוגיה מבנית 9 בהכנות לניסויים נוספים, כאמור. כאפיון ביוכימי / biophysical, התגבשות, וכו '., מאמצים ראשוניים בדרך כלל להתמקד בהשגת כמות מספקת של נקודתי העניין בצורה טהורה ככל האפשר, באופן אידיאלי כדגימה כימית הומוגנית וbiophysically monodisperse. לאחר ההפרעה של תאים פונדקאיים, בשלבים המוקדמים של עבודת טיהור טיפוסית שואפים לבודד את נקודת העניין מE. חלבונים, חומצות גרעין coli, פסולת דופן תא,ורכיבים אחרים של lysate הסלולרי. עם זאת, המארח NAS עשוי לשתף לטהר עם POI מכמה סיבות physicochemical – POI הבסיסי ביותר עשוי הלא במיוחד נפתח DNA מארח / רנ"א; POI יכול להיות פעילות הגנרית NA-מחייבת (לדוגמה, HU הנ"ל); POI יכול להיות חלבון ספציפי למדי NA-מחייב אבל תערוכת תגובה צולבת עם RNAs המארח או DNAs; המארח NAS עלול ליצור אינטראקציה עם מטריצת כרומטוגרפיה ובכך פשוט שיתוף elute עם POI, וכן הלאה. ללא הבחנה, בעלת זיקה גבוהה מחייב של המארח NAS לPOI יכול להוות בעיה מציקה, כי זיהומי NA סביר יפריעו ניסויים במורד זרם (לדוגמה, מבחני אנאיזוטרופיה קרינה של POI • RNA מחייב 10). לחלופין, POI בלתי צפוי · · · עמותות NA גם ניתן לראות במקרה, כאינטראקציות כאלה להאיר קיבולת חומצת גרעין המחייב של נקודת העניין. כך או כך, בין אם הם מרכיבי NAS או מזהמים עיקריים, צריך לכמת ראשון ולזהות את הסוג (DNA, RNA) של שיתוף מטהר NAS בהכנה לניסויים במורד זרם.
מספר שיטות אנליטיות קיימות לאיתור וquantitating NAS במדגם. רוב השיטות הזמינות באופן מהותי או spectrophotometric (למשל, 260 ערכי ספיגה ו260 / A 280 ratios), fluorometric (למשל, מחייב thiazole כתום או צבעי ניאון אחרים לנ"א), או colorimetric (רגישות של נוקלאוזידים לתגובות כימיות שchromophores תשואת קליטה באזור UV-VIS של הספקטרום האלקטרומגנטי), כפי שתואר לאחרונה על ידי דה מיי et al. 1 עם זאת, הצעד החיוני לזיהוי הסוג של polynucleotide כRNA או DNA הוא מעבר להיקף של רבים מאלה quantitation גישות. כאן אנו מספקים סדרה של מבחני colorimetric לזהות במהירות את סוגי רכיבי NA במדגם חלבוניים.
הפרוטוקולים מתוארים כאן גיבוצע ביעילות ללא צעדים נוספים של בידוד זיהומי NA הפוטנציאליים, ולהסתמך על הבדיקה של בנדיקט להפחתת סוכרים 11, assay orcinol לpentoses 12,13, ותגובות של diphenylamine 14,15 2'-deoxypentoses (תרשימי 1 ו 2) . מבחנו של בנדיקט (איור 2a) מנצל את היכולת של השרשרת הפתוחה (אלדהיד) הטופס ליניארי, של סוכר aldose להפחית Cu 2 +, עם חמצון קשור של קרבוניל של הסוכר למחצית carboxylate וייצור של Cu 2 O כ משקע אדום מסיס. תגובה זו תהיה מבחן חיובית עם הפחתת סוכרים חינם כגון aldoses וketoses (אשר להמיר לaldoses המתאים דרך ביניים enediol), אך לא עם סוכרי פנטוז שנעולים בצורה מחזורית כחלק מעמוד השדרה קוולנטי של DNA או RNA polynucleotide. בגלל הדרישה של מינימליסטי פונקציונלי hemiacetal חופשי, שיתוף אחרmpounds שיכולים בדיקה חיובית בבדיקה זו – ולכן יפעל כinterferents פוטנציאלי – כולל α-hydroxy-קטונים ואוליגוסכרידים קצרים (מלטוז disaccharide למשל). שניהם יאל של orcinol (האיור 2b) ותגובות diphenylamine של Dische (איור 2 ג) מבוססות על הרס ראשוני של עמוד שדרת polynucleotide, דרך depurination של nucleoside וחומצה או עוד יותר הידרוליזה בסיס קטליזאטור של נוקלאוטידים ההורי, כדי להניב furan-2 -Carbaldehyde (furfural) נגזרים; הנגזרים האלה אז להגיב עם או polyhydroxy פנול כגון orcinol (יאל של) או diphenylamine (Dische של) ריאגנטים ליצירת מוצרי עיבוי צבעוניים של מבנה כימי הידוע ברובם. דנ"א לעומת רנ"א ספציפי של assay של Dische נובע מהעובדה שסוכר הפנטוז חייב להיות 2'-deoxygenated כדי להיות רגיש לחמצון לאלדהיד ω-hydroxylevulinyl, אשר עוד מגיב עם diphenylamineתחת תנאים חומציים להניב בהירים כחולים מעובים (איור 2 ג). שימוש בפרוטוקולים היעילים שתוארו כאן, יש לנו מצאנו שתגובות colorimetric סוכר ספציפיים אלה יכולים להבחין בין רנ"א ודנ"א, וגם מצביעות על הנוכחות של סוכרי הפחתה חינם כגון גלוקוז, פרוקטוז, או ריבוז במדגם biomolecular.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחני colorimetric מוצגים כאן מציעים גישה פשוטה במהירות כדי להעריך את האופי הכימי של תערובות biomolecular, כגון הם נתקלו בעת טיהור חלבונים, RNAs או מתחמים מlysate כל התאים בהכנה למחקרים נוספים. כביולוגיה מבנית רודפת מכלולים נוספים יליד דמוי, אתגרים גדולים יותר בהדרגה, כגון הטרוגנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת וירג'יניה וJeffress זכרון הנאמנות (J-971). אנו מודים ל 'קולומבוס, ק ג'אין, ופ רנדולף לדיונים מועילים וקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Reagent or equipment | Supplier/company | Catalog number | Comments, notes |
| Anhydrous sodium carbonate | Fisher Scientific | S263 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma | S-4641 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | VWR | VW3312-2 | |
| Orcinol monohydrate | Sigma-Aldrich | O1875 | |
| Concentrated HCl | VWR | BDH3030 | |
| Ferric chloride hexahydrate | Sigma | F-2877 | |
| Diphenylamine | Aldrich | 112763 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A28 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Ribose | Sigma | R-7500 | prep at 1% w/v in H2O |
| Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma | R6750 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C |
| Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus | Sigma | D1501 | prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C |
|
Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety. |
References
- De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Ausubel, F. M. . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).
- Voet, D., Voet, J. G. . Biochemistry. , (2011).
- Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. . The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).
- Rice, P. A., Correll, C. C. . Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).
- Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).
- Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
- Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
- Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
- Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
- Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
- Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
- Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
- Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
