Assay גופיים תא דם אדום המוליזה להערכת סוכני Endosomolytic pH המגיבים למשלוח cytosolic של סמי Biomacromolecular
Summary
Assay המוליזה יכול לשמש כמסך מהיר, תפוקה גבוהה של cytocompatibility "מערכות אספקת סמים ופעילות endosomolytic למסירת מטען תאית. הבדיקה מודדת את השיבוש של קרום כדורי אדום כפונקציה של pH הסביבה.
Abstract
bilayers פוספוליפידים שמרכיב שלפוחית Endo-lysosomal יכול להוות מכשול למשלוח של תרופות ביולוגיות למטרות תאיות. כדי להתגבר על המכשול הזה, מספר נישאי תרופות סינטטיים כבר מהונדס באופן פעיל כדי לשבש את קרום endosomal ולספק סחורות לציטופלסמה. כאן, אנו מתארים את assay המוליזה, שיכול לשמש גם כמסך מהיר, תפוקה גבוהה ולפעילות cytocompatibility endosomolytic של מערכות אספקת סמים תאיות.
בבדיקת המוליזה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף הדגרו בחוצצים בPHS המוגדר המחקים סביבות תאיות, מוקדם endosomal, ומאוחר Endo-lysosomal. בעקבות צעד צנטריפוגה לתאי דם אדומים שלמים גלולה, כמות ההמוגלובין משתחררת למדיום נמדדה spectrophotometrically (405 ננומטר לטווח דינמי הטוב ביותר). אז שיבוש תאי הדם האדום הוא לכמת אחוזים יחסית לשליטת samp החיוביles lysed עם חומר ניקוי. במערכת מודל זה קרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית Endo-lysosomal. התוצאה הרצויה היא המוליזה זניח ב-pH הפיזיולוגי (7.4) והמוליזה חזקה בטווח pH Endo-lysosomal מכ חומציות 5-6.8.
Introduction
אמנם יש מטרות פוטנציאליות רבות השפעה גבוהה טיפוליות בתוך התא, משלוח תאיים של סוכנים מהווה אתגר משמעותי. לעתים קרובות, תרופות, בעיקר ביולוגי, הם הפנימו על ידי תאים ונסחרים בשלפוחית כי גם להוביל להידרדרות התכנים שלהם דרך מסלול Endo-lysosomal, או מועברים מדלת אחורית של התא דרך exocytosis. 1 בתהליך האחרון, pH הפנימי של השלפוחית היא acidified לכ 5-6, המהווה את ה-pH האופטימלית לפעילות של אנזימים המתפקדים בתא זה, כגון Lysozyme 2.
לאחרונה, מספר החומרים שתוכנן במיוחד כדי למנף את ההחמצה של endosomes להקל על הגשת cytosolic של המטען. אחת דוגמאות לגישה זו משתמשת, חלקיקי פולימר סינטטיים micelle ליבה שלהם הוא zwitterionic ותשלום ניטראלי ב pH הפיזיולוגי (כלומר 7.4). עם זאת, ב6.0 pH- 6.5, הפולימרים הפכו protonated ולרכוש מטען חיובי נטו שמערער ליבת micelle, ומגזרי הפולימרים נחשפו אינטראקציה עם ולשבש את קרום endosomal. פעילות זו הוכחה לקדם את בריחת endosomal של רפוי פפטידים וחומצות גרעין מבוסס, המאפשר להם לגשת למטרות cytosolic. 3,4 דוגמאות נוספות לשיטות שפותחו לתווך בריחת endosomal שישבש את מחסום הקרום כוללים פפטידים 'fusogenic' או חלבונים שיכולים לתווך איחוי או היווצרות נקבובית חולפת בbilayer פוספוליפידים. 5 Homopolymers של חומצות אקריליק אלקיל anionic כגון פולי (חומצת propylacrylic) הם עוד גישה למד היטב, ובפולימרים אלו, מדינת protonation של חומצת carboxylic תליון מכתיבה מעבר לידרופובי, מדינת קרום מפריע בטווחי pH Endo-lysosomal. 6,7
מערכת מודל שימושית אחד לסינון התנהגות endosomolytic היא הדוארassay x vivo החומציות התלויה המוליזה. 8 במערכת מודל זה, הקרום הכדורי האדום משמש כתחליף לשומני קרום bilayer שמצרף שלפוחית Endo-lysosomal. מודל הכללה זו נעשה שימוש על ידי אחרים כדי להעריך את התנהגות endosomolytic של פפטידים תא חודרים ומערכות אספקה אחרות פולימריים גנים. 8-11 בניסוי זה, תאים אנושיים דם אדומים וחומרי בדיקה הם שיתוף מודגרות-בחוצצים בPHS המוגדר המחקים תאיות (7.4), מוקדם endosomal (6.8), ומאוחר Endo-lysosomal (<6.8) הסביבות. כמות ההמוגלובין שפורסם במהלך תקופת הדגירה היא לכמת כמדד לתמוגה תאי דם אדומה, שמנורמלת לכמות ההמוגלובין פרסמה בדגימות בקרה חיוביות lysed עם חומר ניקוי.
מהקרנת ספרייה קטנה של חומרי בדיקת הפוטנציאל endosomolytic, ניתן להסיק כי דגימות שמייצרות לא המוליזה ב-pH 7.4, אבל שולים גבוהים באופן משמעותיolysis ב-pH <6.5, יהיה המועמדים היעילים וcytocompatible ביותר עבור משלוח סמים cytosolic. חומרים המתאימים לקריטריונים אלו יהיו צפויים להישאר אדישים ולא להרוס ללא הבחנה קרומי bilayer שומנים (כלומר שעלולה לגרום cytotoxicity) עד שנחשף לירידה ברמת החומציות המקומית בעקבות הפנמה לתאי אנדו-lysosomal.
בפרוטוקול זה, אריתרוציטים מבודדים מתורם אנושי ושיתוף מודגרות-ב-pH 5.6, 6.2, 6.8, או 7.4 עם סוכני משלוח ניסיוניים endosomolytic סמים. אריתרוציטים שלמים pelleted, וsupernatants (המכיל המוגלובין שוחרר מאריתרוציטים lysed) מנותח לספיגה האופיינית למוגלובין באמצעות קורא צלחת (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
פולימרים המגיבים לרמת חומציות או סוכנים אחרים שנועדו לתפקוד endosomolytic יכולים להיות מוקרן במהירות וביעילות על בסיס תמוגה של תאי דם אדומים בערכי pH נתקלו בendosome (איור 1; pH 6.8 – endosome מוקדם, pH 6.2 – endosome מאוחר, pH 5.6 – lysosome). 14-17 המוליזה חומציות תלויה נעשה שימוש כדי להק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
החוקרים מכירים במימון באמצעות משרד הגנת תוכניות בימוי congressionally מחקר רפואיים (# W81XWH-10-1-0445), מכונים לאומיים לבריאות (NIH R21 HL110056), ואיגוד לב אמריקאי (# 11SDG4890030).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
