Ex Vivo Red Blood Cell Hemolyse Assay voor de beoordeling van de pH-responsieve Endosomolytic Agenten voor Cytosolic Levering van Biomacromoleculaire Drugs

Hoewel er vele mogelijke high-impact therapeutische targets in de cel, de intracellulaire afgifte van middelen vormt een grote uitdaging. Vaak worden drugs, vooral biologische, geïnternaliseerd door cellen en verhandeld in blaasjes die ofwel leiden tot afbraak van de inhoud door de endo-lysosomale route, of back brachten de cel via exocytose. ¹ In de laatste werkwijze, de interne pH van de vesicles wordt aangezuurd tot ongeveer 5-6, met de optimale pH voor activiteit van enzymen die functioneren in dit compartiment, zoals lysozym. ^twee

Recent zijn een aantal materialen zijn speciaal ontworpen om gebruik te maken van de verzuring van endosomen te vergemakkelijken cytosolische levering van hun lading. Een voorbeeld van deze benadering maakt gebruik van synthetische polymeer micel nanodeeltjes die kern zwitterionische en lastenneutraal bij fysiologische pH (bijv. 7,4). Echter bij pH 6,0- 6.5, de polymeren worden geprotoneerd en zich een netto positieve lading die de micel kern destabiliseert en de blootgestelde polymeersegmenten interactie met en verstoren de endosomale membraan. Deze activiteit is aangetoond dat het endosomale ontsnappen van peptide en nucleïnezuur gebaseerde geneesmiddelen bevorderen, waardoor zij hun targets cytosolische openen. ^3,4 Andere voorbeelden van ontwikkelde methoden endosomale escape dat het membraan barrière verstoren bemiddelen omvatten "fusogenische" peptiden of eiwitten die membraanfusie of transient poriënvorming kunnen bemiddelen in de fosfolipide dubbellaag. ⁵ Homopolymeren van anionogene alkyl acrylzuren zoals poly (propylacrylic zuur) een goed bestudeerde benadering en in deze polymeren, de protonering staat hanger carbonzuur dicteert overgang in een hydrofoob, membraan-ontwrichtende staat in endo-lysosomale pH-bereiken. ^6,7

Een bruikbaar model systeem voor het screenen van endosomolytic gedrag is het ex vivo pH-afhankelijke hemolyse assay. ⁸ In dit modelsysteem de erytrocytenmembraan dient als een surrogaat voor het lipidebilaagmembraan die endo-lysosomale vesicles omsluiten. Dit model generaliseerbaar is door anderen om endosomolytic gedrag van cellen binnendringen peptiden en andere polymere genafgiftesystemen evalueren. ^8-11 In dit experiment menselijke rode bloedcellen en testmaterialen worden geco-incubeerd in buffers bij pH gedefinieerd dat nabootsen extracellulaire (7,4), vroege endosomale (6,8), en laat endo-lysosomale (<6,8) omgevingen. De hoeveelheid hemoglobine vrijkomt tijdens de incubatieperiode wordt gekwantificeerd als een maat van rode bloedcellen lysis, die is genormaliseerd naar de hoeveelheid hemoglobine model in positieve controlemonsters gelyseerd met een reinigingsmiddel.

Van het screenen van een kleine bibliotheek van potentieel endosomolytic testmateriaal, kan men afleiden dat de monsters die geen hemolyse produceren bij pH 7,4, maar significant verhoogd zoomolysis bij pH <6,5, zal de meest effectieve en cytocompatible kandidaten voor cytosolische drug delivery. Materialen die deze criteria past worden naar verwachting inert en niet zonder lipide dubbellaag membranen (bijv. waardoor cytotoxiciteit) vernietigen tot blootstelling aan een daling in de lokale pH na internalisatie in endo-lysosomale compartimenten.

In dit protocol worden erythrocyten geïsoleerd uit een menselijke donor en co-geïncubeerd bij pH 5,6, 6,2, 6,8 of 7,4 experimentele endosomolytic drug delivery agents. Intact erytrocyten worden gepelleteerd en de supernatanten (met hemoglobine bezit van gelyseerde erytrocyten) geanalyseerd voor de karakteristieke absorptie van hemoglobine via een plaatlezer (figuur 1).