Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

Embora existam muitos potenciais de alto impacto alvos terapêuticos no interior da célula, a entrega intracelular de agentes representa um desafio significativo. Frequentemente, as drogas, especialmente produtos biológicos, são internalizados pelas células e de tráfico dentro de vesículas que, ou levar a uma degradação do seu conteúdo através da via endo-lisossomal, ou são transportados de volta para fora da célula através de exocitose. ¹ No último processo, o pH interno das vesículas é acidificada para cerca de 5-6, que é o pH óptimo para a actividade das enzimas que funcionam neste compartimento, tal como a lisozima ^2.

Recentemente, um certo número de materiais foram especificamente concebidos para aproveitar a acidificação dos endossomas para facilitar a entrega citosólica da sua carga. Um exemplo desta abordagem utiliza sintéticos, as nanopartículas de polímeros de micelas cujo núcleo é zwitteriónicos e carga neutra a um pH fisiológico (isto é, 7.4). No entanto, a pH 6,0- 6,5, os polímeros tornam-se protonado e adquirem uma carga positiva, que desestabiliza o núcleo micelar, e os segmentos de polímeros expostos interagir com e romper a membrana endossomal. Esta actividade tem sido mostrado para promover a fuga endossomal de péptidos e ácidos nucleicos baseados em terapêutica, o que lhes permite aceder aos seus alvos citosólicas. ^3,4 Outros exemplos de métodos desenvolvidos para mediar fuga endossomal que interromper a barreira da membrana incluem as "" péptidos fusogénicos ou proteínas que podem mediar a fusão da membrana, ou a formação de poros transientes na bicamada fosfolipídica. ⁵ homopolímeros de ácidos acrílicos aniónicos de alquilo, tais como poli (ácido propylacrylic) são outra abordagem bem estudada e, nestes polímeros, o estado de protonação do ácido carboxílico pendente dita transição em um hidrofóbico, estado da membrana disruptiva em gamas de endo-lisossomais pH ^6,7.

Um sistema modelo útil para a triagem comportamento endosomolytic é o e-x dependente do pH in vivo ensaio de hemólise. ^{8 Neste} sistema modelo, a membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. Este modelo generalizável tem sido utilizado por outros para avaliar o comportamento de células endosomolytic penetrantes péptidos e outros sistemas de entrega de genes poliméricos. ^8-11 Nesta experiência, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pH definidos que imitam extracelulares (7,4), no início endossomais (6,8), e no final endo-lisossomal (<6,8) ambientes. A quantidade de hemoglobina libertada durante o período de incubação é quantificada como uma medida da lise dos glóbulos vermelhos, que é normalizado para a quantidade de hemoglobina libertada nas amostras de controlo positivo lisadas com detergente.

De rastreio de uma pequena biblioteca de materiais de teste potencialmente endosomolytic, pode-se inferir que as amostras que não produzem hemólise, a pH 7,4, mas bainha significativamente elevadosolysis a pH <6,5, serão os candidatos mais eficazes e cytocompatible para a entrega da droga citosólica. Os materiais que se enquadram nestes critérios seria de esperar que permanecem inertes e não indiscriminadamente destruir bicamadas lipídicas (isto é, que poderia causar a citotoxicidade) até serem expostos a uma queda no pH local na sequência de internalização em endo-lisossomais compartimentos.

Neste protocolo, os eritrócitos são isoladas a partir de um dador humano e co-incubou-se a pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 com experimentais agentes de entrega de droga endosomolytic. Eritrócitos intactos são sedimentadas e os sobrenadantes (que contêm hemoglobina libertada a partir de eritrócitos lisados) são analisadas para a característica de absorção de hemoglobina através de um leitor de placa (Figura 1).