Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs

Obwohl es viele potenzielle high-impact therapeutische Ziele innerhalb der Zelle sind, stellt die intrazelluläre Abgabe von Mitteln eine große Herausforderung. Häufig werden Drogen, insbesondere Biologika, durch Zellen internalisiert und gehandelte zu Vesikeln, dass entweder eine Verschlechterung ihres Inhalts durch die Endo-lysosomalen Weg führen, oder zurück aus der Zelle über pendelte Exozytose. ¹ Bei letzterem Verfahren, das interne pH der Vesikel auf etwa 5-6 angesäuert, welches der optimale pH für die Aktivität von Enzymen, die Funktion in diesem Abteil, wie Lysozym. ²

In jüngster Zeit haben eine Reihe von Materialien speziell zu nutzen, die Versauerung der Endosomen, um cytosolische Lieferung von ihrer Ladung zu erleichtern entwickelt. Ein Beispiel für diesen Ansatz verwendet synthetische, Polymermizelle Nanopartikel, deren Kern im zwitterionischen und ladungsneutrale bei physiologischem pH (dh 7,4). Jedoch bei pH 6,0- 6.5, wobei die Polymere zu erwerben protoniert und eine positive Nettoladung, die die Micellkerns destabilisiert, und die freiliegenden Polymersegmente interagieren und stören die endosomale Membran. Diese Aktivität wurde gezeigt, dass die endosomalen Entweichen von Peptid und Nucleinsäure-Therapeutika zu fördern, so dass sie ihre Ziele cytosolischen übersetzen. ^3,4 Andere Beispiele von Methoden entwickelt, die den Escape-endosomalen Membranbarriere stören vermitteln beinhalten 'fusogenen' Peptide oder Proteine, die Membranfusion oder transiente Porenbildung in der Phospholipid-Doppelschicht vermitteln können. ⁵ Homopolymerisate von anionischen Alkylacrylsäuren wie Poly (Propylacrylsäure) sind eine weitere gut untersuchten Ansatz, und in diesen Polymeren, bestimmt der Protonierungsgrad von anhängenden Carbonsäure Übergangs in eine hydrophobe, Membran-disruptive Zustand in endo-lysosomalen pH-Bereiche. ^6,7

Ein nützliches Modell für das Screening endosomolytischen Verhalten ist die ex vivo pH-abhängig Hämolyse-Assay. ⁸ In diesem Modellsystem dient die Erythrozytenmembran als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht-Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Dieses Modell generalisierbar von anderen verwendet worden, um die endosomolytische Verhalten zellpenetrierendes Peptide und andere polymere Genabgabesysteme auszuwerten. ^8-11 In diesem Experiment sind menschliche rote Blutzellen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die imitieren coinkubiert extrazellulären (7,4), frühe Endosomen (6,8), und am späten endo-lysosomalen (<6,8) Umgebungen. Die Menge an Hämoglobin während der Inkubationszeit freigesetzt wird als Maß für die Lyse der roten Blutkörperchen, die der Menge an Hämoglobin im positiven Kontrollproben mit einem Detergens lysiert freigesetzt normalisiert wird quantifiziert.

Von Screening einer kleinen Bibliothek von potenziell endosomolytischen Testmaterialien, kann man folgern, dass Proben, die keine Hämolyse produzieren bei pH 7,4, aber deutlich erhöhten Saumolysis bei pH <6,5, werden die effektivsten und cytocompatible Kandidaten für cytosolische Drug Delivery sein. Materialien, die diese Kriterien erfüllen würde voraussichtlich nicht inert und nicht wahllos zerstören Lipiddoppelschichtmembranen (dh, die Zytotoxizität führen können) bis an einen Abfall der lokale pH-Wert nach Internalisierung in endo-lysosomaler Kompartimente ausgesetzt werden.

In diesem Protokoll werden Erythrozyten von einem menschlichen Spender isoliert und bei pH 5,6, 6,2, 6,8 oder 7,4 mit experimentellen endosomolytische Arzneimittelabgabe Mittel co-inkubiert. Intakte Erythrozyten werden pelletiert, und die Überstände (enthaltend Hämoglobin aus lysierten Erythrozyten freigesetzt) ​​für die charakteristische Absorption von Hämoglobin über einen Plattenleser (Abbildung 1) analysiert.