Ex Vivo красных клеток крови Гемолиз анализа для оценки рН реагировать эндосомолитический агентов для цитозольного поставки наркотиков Biomacromolecular
Summary
Гемолиз анализ может быть использован в качестве быстрого, высокую пропускную способность экрана системы доставки лекарственных средств "cytocompatibility и эндосомолитический деятельности для внутриклеточной доставки грузов. Анализ измеряет нарушение мембран эритроцитов в зависимости от рН среды.
Abstract
Фосфолипидного бислоя, которые представляют собой эндо-лизосомных пузырьков может создать барьер для доставки биологических препаратов на внутриклеточные мишени. Чтобы преодолеть этот барьер, количество синтетических наркотиков носителей были разработаны активно нарушать эндосомного мембраны и доставить груз в цитоплазму. Здесь мы описываем гемолиза анализа, который может быть использован в качестве быстрого, высокой пропускной способностью экрана для cytocompatibility и эндосомолитический активность внутриклеточных систем доставки лекарственных средств.
В гемолиза анализ, эритроциты человека и испытания материалов совместно инкубируют в буфер при определенных значениях рН, которые имитируют внеклеточной, рано эндосомного, и в конце эндо-лизосомальных среды. После центрифугирования для осаждения нетронутыми эритроцитов, количество гемоглобина попадает в среду измеряется спектрофотометрически (405 нм для лучшего динамического диапазона). Процентов красные разрушение клеток крови, то количественно по сравнению с положительным контролем SAMPле лизируются с моющим средством. В этой модели система мембран эритроцитов служит заменителем липидного бислоя мембраны, окружающие эндо-лизосомных пузырьков. Желаемый результат можно пренебречь гемолиза при физиологических рН (7,4) и надежные гемолиза в эндо-лизосомальных диапазоне рН примерно от рН 5-6.8.
Introduction
Хотя есть много потенциально высокой отдачей терапевтические мишени внутри клетки, внутриклеточной доставки агентов представляет собой значительную проблему. Часто, наркотики, особенно биопрепаратов, усваиваются клетками и продают в пузырьках, которые либо приводят к ухудшению их содержимого через эндо-лизосомальных пути, или курсировал обратно из клетки с помощью экзоцитоза. 1 В последнем процессе, внутренние рН пузырьков подкисляют до примерно 5-6, который является оптимальным рН на активность ферментов, которые функционируют в этот отсек, такие как лизоцим 2.
В последнее время ряд материалов, которые были специально разработаны для привлечения подкисления эндосомы для облегчения цитозольного доставки своего груза. Одним из примеров такого подхода используются синтетические, полимерные мицеллы наночастиц ядро которого цвиттерионные и заряда нейтральными при физиологических рН (т.е. 7,4). Тем не менее, при рН 6,0- 6,5, полимеры становятся протонирована и приобретают положительный заряд, что дестабилизирует мицеллы ядро, и открытые сегменты полимера взаимодействуют и нарушить эндосомного мембраны. Эта деятельность была показана по содействию эндосомного выхода пептидов и нуклеиновых кислот основе терапии, что позволит им получить доступ к своим цитозольного целей. 3,4 Другие примеры методов, разработанных для посредников эндосомного побега, которые разрушают мембраны барьера включают "fusogenic" пептиды или белков, что может выступить посредником слияние мембран или переходные образования пор в фосфолипидного бислоя. 5 Гомополимеры анионных алкил кислот акрилового такие как поли (propylacrylic кислоты) являются еще одним хорошо изученный подход, и в этих полимеров, протонирование состояние кулон карбоновой кислоты диктует переход в гидрофобных, мембраны прерывания государства в эндо-лизосомальных диапазонах рН. 6,7
Одним из полезных модель системы для скрининга эндосомолитический поведение электроннойх естественных условиях рН-зависимого гемолиза анализа. 8 В этой модельной системы, мембраны эритроцита служит заменителем липидного бислоя мембраны, окружающие эндо-лизосомных пузырьков. Это обобщению модели была использована другими для оценки эндосомолитический поведение клеточной проникающих пептидов и других полимерных систем доставки генов. 8-11 В этом эксперименте, эритроциты человека и испытания материалов совместно инкубируют в буфер при определенных значениях рН, которые имитируют внеклеточный (7,4), рано эндосомного (6,8), и в конце эндо-лизосомальных (<6,8) среде. Количество гемоглобина выпущен в течение инкубационного периода количественно как меру красно лизис клеток крови, которая нормирована на количество гемоглобина выпущен в положительные контрольные образцы лизируются с моющим средством.
От скрининга небольшая библиотека потенциально эндосомолитический тестовых материалов, можно сделать вывод, что образцы, которые не производят гемолиз при рН 7,4, но значительно повышенные подолеolysis при рН <6,5, будет наиболее эффективным и cytocompatible кандидатов на цитозольной доставки лекарственных средств. Материалы, которые соответствуют этим критериям можно было бы ожидать, чтобы оставаться инертным и не без разбора уничтожить двухслойных липидных мембран (например, которые могут привести к цитотоксичности), пока не подвергаясь капля в местном рН после интернализации в эндо-лизосомальных отсеков.
В этом протоколе, эритроциты изолированы от человека-донора и совместно инкубировали при рН 5,6, 6,2, 6,8 или 7,4 с экспериментальными эндосомолитический агентов доставки лекарственных средств. Интактные эритроциты осаждают, а супернатанты (содержащие гемоглобин освобожден из лизированных эритроцитов), анализируются характерные для поглощения гемоглобина через ридер (рис. 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
рН-отзывчивым полимеров или других агентов, предназначенных для эндосомолитический функции могут быть быстро и эффективно экранируется на основе лизиса эритроцитов при значениях рН, встречающихся в ядрышко (рис. 1; рН 6,8 – начале ядрышко, рН 6,2 – поздно ядрышко, рН 5,6 – лизосом). <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, финансирование через Министерство обороны Конгрессом Режиссер медицинских программ исследований (# W81XWH-10-1-0445), Национальных Институтов Здоровья (NIH R21 HL110056) и Американской ассоциации сердца (# 11SDG4890030).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco’s PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -. P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. . Data for Biochemical Research. , (1986).
- Ernst, D. J. . Applied Phlebotomy. , (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
