Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em> En el útero</em> La electroporación y<em> En vivo</em> Detección bioluminiscencia

Todos los experimentos con animales fueron autorizados por el responsable Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301), de conformidad con la legislación nacional y europea. 1. En el útero de electroporación Este método ha sido descrito en detalle en JoVe para la rata por Walantus et al. 3, así como Rice et al. 4 y se resumen aquí sólo brevemente. Un tamaño de la camada de 6-8 cachorros se obtiene un buen resultado. Debe haber por lo menos dos embriones no electroporadas con el fin de aumentar la tasa de supervivencia global (ver más abajo). Preparar ADN-Mezcla que contiene 1,5 g / l de meta-plásmido (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, Eugene, Oregón / DISC1 sobreexpresión: pCAX 21), 0,5 g / l de luciferasa que contiene el plásmido (pCAX), 0,5 g / l de GFP que contiene el plásmido (pCAGGS 22) en 1x PBS solución teñida azul ligeroe con Fast Green Dye. Preparar agujas de inyección de capilares de vidrio con una aguja de pipeta Extractor. Y esterilizar instrumentos quirúrgicos, ya sea en autoclave o por incubación con un desinfectante a base de alcohol (Kodan Tinktur forte). Administrar una dosis pre-operatorio de la buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 min antes de la cirugía a una rata preñada 16 días después de la fertilización (E16). Entonces anestesiar al animal en una cámara de isoflurano. Tras la anestesia, colocar la rata en una posición supina en una mesa de operación de calentado-C 37 ° con la máscara de respiración conectado al dispositivo de anestesia, mediante configuración de oxígeno a 0,4 L / min y isoflurano en 1,8%. Después de afeitarse el abdomen, desinfectar la zona afeitada tres veces con Kodan Tinktur Forte (un desinfectante a base de alcohol). Cubra la rata con paños estériles, exponiendo sólo el campo de operación afeitado. Realizar en el útero de la electroporación. Cortar el abdomen con un scissor lo largo de la línea alba (~ 2 cm). Exponer los cuernos uterinos con cuidado con unas pinzas de anillo. Tenga cuidado de mantener la pared del útero húmedo con PBS estéril calentado durante toda la cirugía. Inyectar la solución de ADN con una aguja de vidrio fina en uno del ventrículo lateral de los embriones. Coloque el electrodo 7 mm alrededor de la cabeza del embrión. Para golpear una población de células de las capas corticales superiores, realice el IUE en E16 23 y coloque el electrodo positivo en el hemisferio por encima del ventrículo inyectado con una ligera tendencia dorsal / lateral. Para dirigirse a las células del hipocampo cambian la colocación de los electrodos positivo hacia el lado opuesto de la ventrículo inyectado con lateral a ligeramente dirección dorsal (Figura 1). Lleve a cabo la electroporación por cinco pulsos 50 ms a 55 V con 950 saltos ms con una onda cuadrada electroporador pulso. Piezas de la primera embrión en el extremo vaginal de cada cuerno uterino con el fin de aumentar la Tque las posibilidades de supervivencia de todos los embriones. Ponga los cuernos del útero de nuevo en la rata madre. Stich de la pared abdominal con un material de sutura quirúrgica absorbible Vicryl. Cierre la piel con el material de sutura Vicryl o con clips de sutura. Coloque la rata madre de nuevo en la jaula y mantenerlo caliente durante 2-3 horas. Mantenga las ratas solo en su jaula en la sala de instalaciones de animales y se alimentan ad libitum. Dan a luz entre E22-24. Mantenga las crías de rata con su madre durante tres semanas y luego separarlos por sexo. 2. La bioluminiscencia de imágenes en vivo de la reacción enzimática de luciferasa Este método se utiliza para analizar la posición de las células transfectadas en el útero. Electroporación-Co ADNc de luciferasa de luciérnaga se traduce en luciferasa activa, que, después de la metabolización de D-luciferina a oxiluciferina, emite un fotón (Figura 2 </strong>). La luminiscencia resultante se puede detectar en el cerebro de ratas jóvenes a electroporación positivos en un espectro IVIS hasta la edad de alrededor de 35 días después del nacimiento (Figura 4). En el presente estudio, se realizó el ensayo de luciferasa de imágenes y bioluminiscencia comenzando en P7. Este punto de tiempo fue elegido para permitir la madre y los cachorros para recuperarse del estrés del nacimiento. Cuando se trabaja inicialmente con los cachorros en P0, supervivencia de las crías se vio gravemente afectada en que los cachorros fueron encontrados muertos o ingeridos por la madre. Inicialmente, las crías de rata con electroporación con éxito son identificados por una imagen 2D-bioluminiscencia con un tiempo de exposición de tres minutos. Posteriormente, cachorros positivos se utilizan para crear imágenes en 3D con el fin de especificar la ubicación de la zona a electroporación. Diluir la sal de sodio-D luciferina en PBS a una concentración de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa estéril. Sopesar los cachorros. Tome el cachorro en una mano con el abdomen en la parte superior y estirar el abdomen ligeramente. Inyectar 10 l / g de peso corporal de luciferina intraperitoneal solución. Para los más viejos y más ágiles, pre-anestesiar a los cachorros con isoflurano en la cámara de inducción antes de la inyección de la luciferina. Encienda la afluencia isoflurano del Sistema Gasista Anestesia XGI-8 dentro del espectro IVIS con 3% de isoflurano. Ponga el hocico del animal en los conos de ojiva de cristal del Sistema de Anestesia. Mantenga el animal en una posición boca abajo hasta que esté en anestesia profunda (2-3 min). Entonces reducir la afluencia isoflurano al 1,5%. Elija una medición 2D-bioluminiscencia para seleccionar cachorros positivos de toda la camada. Utilice la siguiente configuración Haga clic aquí para ver más grande la figura . Establezca un CHECkmark en la fotografía con binning medio y F / Stop a las 8, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición. Establece filtro de excitación: bloque. Establece filtro de emisiones: abierto. Establecer Binning a medio. Set F / Stop en 1. Ajuste el nivel de la etapa A. Establecer luminiscencia tiempo de exposición a 180 seg. Para la creación de imágenes en 3D con el fin de cuantificar mejor el área a electroporación de los cachorros positivos, utilice la siguiente configuración DLIT de luciferasa de luciérnaga. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Establecer una marca de verificación en la fotografía, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición. Establecer una marca de verificación en la estructura, la superficie del animal se escanea por el IVIS antes de la medición de bioluminiscencia. USE siguientes filtros de emisión y los ajustes de tiempo de exposición hasta la edad de dos semanas; Filtro de Emisiones 1: 590 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de Emisiones 2: 600 nm, tiempo de exposición 240 sec Filtro de emisión 3: 620 nm, tiempo de exposición de 180 segundos Filtro de emisión 4: 640 nm, tiempo de exposición de 120 segundos Para las ratas mayores de P20 Filtro de Emisiones 1: 600 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de Emisiones 2: 620 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de emisión 3: 640 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Haga clic aquí para ver más grande la figura . Debido a la disminución de la intensidad de la señal en los animales más viejos, el tiempo de exposición se amplía para los tres mejores filtros de emisión. Ajuste el nivel de la Etapa B Establecer Binning a medio. Set F / Stop en 1 Después de la medición, mar k las ratas por un código earhole para diferenciarlos unos de otros y hacerlo coincidir con las imágenes en vivo de imágenes IVIS Al final del procedimiento de medición, apague afluencia isoflurano y mantener la rata en la placa calentada durante algunos minutos antes de volver a su jaula. 3. Análisis de la bioluminiscencia Imágenes La generación de imágenes en 3D, películas en 3D y la cuantificación del volumen de la fuente de la señal se realiza mediante el software Living Image preinstalado en el espectro IVIS. Generación de imágenes en 3D En primer lugar, la reconstrucción de una topografía de la superficie, por lo tanto, establecer el umbral entre el 20-30%. Haga clic aquí para ver más grande la figura . een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> Comience reconstrucción DLIT 3D con un umbral de imagen del 10% para cada longitud de onda. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Haga clic aquí para ver más grande la figura . Haga clic aquí para ver más grande la figura . Cree películas en 3D utilizando el botón animar dentro de la barra de herramientas 3D. Elige diferentes orientaciones de la imagen 3D, así como vistas de zoom como fotogramas clave y pulse el 'Record & #39, el botón, la grabación de la transición de una posición / orientación a otra. Haga clic aquí para ver más grande la figura . 4. Las pruebas de comportamiento Las pruebas de comportamiento se realizó con el fin de determinar si la manipulación de genes mediados por IUE en ratas podrían iniciar efectos a largo plazo que persisten en la edad adulta. En el presente caso, el efecto de los transitorios, unilateral de larga duración DISC1 humana cortical sobreexpresión después IUE fue investigado por probar la locomoción en un campo abierto (OF), con y sin una dosis baja de la anfetamina, como una prueba específica para la dopamina relacionada comportamiento 24. En un procedimiento similar realizado por Niwa et al. En ratones IUE utilizando caída DISC1, los ratones IUE pero no los controles mostraron hipersensibilidada la anfetamina 18. Las ratas que fueron en el útero a electroporación con un vector que sobreexpresa DISC1 se llevaron a cabo en condiciones de laboratorio con 12 h de luz 07 a.m.-7 p.m. y se alimentaron ad libitum. A los 3 meses de edad, las ratas se sometieron a pruebas de comportamiento. Para la cuantificación de la locomoción como una lectura de los efectos de la anfetamina, un campo abierto de un sistema de actividad Tru Scan situado en una cámara de sonido y de luz aislados se utilizó. Este sistema mide el tiempo de duración y distancia el animal se mueve, el tiempo y la distancia que pasó en el margen o en el centro del campo, así como la cría de comportamiento 25. En el primer día, pruebe después de la inyección de solución salina Pesar los animales. Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución salina (PBS 1x). Inmediatamente después de la inyección, el sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 minutos unad subdividir los datos en 3 x 5 partes min. Ponga el animal de nuevo en su jaula. Segundo día, prueba en la inyección de anfetamina Pesar los animales. Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución de anfetamina 0,5 mg / ml. Inmediatamente después de la inyección de sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 min y subdividir los datos en 3 x 5 partes min. Volver al animal a su jaula. Analizar la locomoción y el comportamiento de crianza generado por un software específico Tru Scan. Crear gráficos con GraphPad (Prism) y calcular las estadísticas por el software de SPSS Statistics.