Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em> Utero</em> Elektroporasyon ve<em> In vivo</em> Biyoparlaklık Eleme
Summary
Genler yetişkin hayvanlarda davranış veya nöropatoloji sonraki çalışmalar için nöronal bağlantı hızlı ve hedeflenen değişiklikleri mümkün kılmak için, E16 de utero elektroporasyon (IUE) in ile korteks veya sıçanın hipokampusun gelişimi sırasında manipüle edilebilir. IUE başarı kontrolü için in vivo görüntüleme doğum sonrası ko-transfekte edilmiş lusiferaz aktive biyolüminesans ile gerçekleştirilir.
Abstract
Utero elektroporasyon (IUE) nöronal gelişimi araştırmak için beyindeki hücrelerin genetik değişimine izin veren bir tekniktir. Şimdiye kadar, bir yetişkin beyinde davranış veya nevropatolojisi araştırmak için İEÜ kullanımı postnatal hayvanlarda non-invazif teknikler ile IUE transfeksiyon başarı izlenmesi için yetersiz yöntemlerle sınırlıdır.
Bu çalışma için, E16 sıçanlar İEÜ için kullanıldı. Embriyoların içine nükleik asitlerin intraventriküler enjeksiyonundan sonra, cımbız elektrot yerleştirme gelişmekte korteks veya hipokampus ya da hedefleme için çok önemliydi.
Ventriküler ko-enjeksiyon ve 3D yazılım ile bir miktar IVIS Spectrum cihazı kullanılarak, doğum sonrası in vivo biyoışıldama ile anestezi canlı yavru P7 intraperitoneal lusiferin enjeksiyondan sonra, transfekte edilmiş hücrelerin bir lusiferaz gen izin izlenmesi, elektroporasyonu.
<pbiyolüminesans ile class = "jove_content"> Alan tanımı açıkça kortikal ve hipokampal electroporations arasında ayrım ve doğumdan sonra 5 hafta kadar zaman içinde uzunlamasına bir sinyal tespit olabilir. Bu görüntüleme tekniği bize 3 aylık yaştan davranışsal araştırmaları gerçekleştirmek için, daha sonra, biyolojik etkilerini tetikleme ve gerekli kabul transfekte hücrelerin yeterli sayıda yavrular seçmek için izin verdi. Bir örnek olarak, bu çalışmada sıçan korteks içine insan tam uzunlukta bir gen ile DISC1 IUE amfetaminin aşırı-duyarlılığa yol açtığını gösterir. Co-GFP ile transfekte doğumdan sonraki 6 ay ≥ mevcut gen ekspresyonunu gösteren cryosections post mortem floresan mikroskobu ile nöronlarda tespit edilebilir.Biz doğum sonrası biyolüminesans görüntüleme sıçanlarda İEÜ ile geçici transfeksiyonlarının başarısını değerlendiren olanak sonucuna varıldı. Neurodevelopmen sırasında topikal gen manipülasyon etkisi üzerinde araştırmalaryetişkin beyin ve onun bağlantısı t büyük ölçüde kolaylaşır. Birçok bilimsel sorular için, bu teknik takviyesi ya da transgenik farelerin kullanımının yerini ve davranışsal nörobilim için yeni bir teknoloji sağlayabilir.
Introduction
Bu göreli kolaylıkla nöro okuyan etkin yana gelişen beyinde gen ekspresyonunun modüle edilmesine izin verir, bir in utero elektroporasyon (IUE) yöntemi geliştirilmesi, bir ara-ile olmuştur. Bir hedef genin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler 1-7 kemirgenlerde embriyonik ve / veya perinatal gelişim sırasında belirli bir beyin bölgesi etkisi nöronal proliferasyon, göç, arborization ve bağlantı eleştirel bir gösterildi. 8-10
Şizofreni nöro anormallikler 11, 12 ve bu nedenle şizofreni için belirlenen aday genlerin çoğu için, örneğin olduğu gibi, nörolojik gelişim üzerindeki potansiyel modüle etkileri incelenmiştir ile ilgili olmuştur akut ve kronik semptomlar ile karmaşık bir ruhsal hastalıktır kesintiye uğramış-in-şizofreni -1 (DISC1) geni 13-15.
Beyin gelişimi regulat olduğunupre-, peri-ve postnatal gelişim dönemlerinde rol oynar genetik faktörler ve çevre ile olan etkileşimleri tarafından ed. Çeşitli davranış bozuklukları için önemli bir risk faktörü genetik fareler 13, 17 göç kusurlarına DISC1 16 gen. DISC1 demonte yol açar ve İEÜ tarafından gelişmekte kortekste DISC1 ifade manipülasyon yetişkin farelerde 18 davranışını etkisi gösterilmiştir.
İEÜ tarafından beyin gen ifadesini kurgulama çeşitli avantajlar transgenik hayvanların nesil üzerinde 19 vardır. İlk olarak, ilgi alanları içinde gen ekspresyon aydan ziyade transgenik kemirgen hatları ıslah birkaç nesillere hafta içinde elde edilir. İkincisi, germ-mühendislik hayvanlarda 20 fenotipleri kalkan olabilir erken gelişim döneminde telafi edici mekanizmalar kaçınılmalıdır. Yalnızca belirli bir hücre popülasyonu veya beynin belirli bir alan, Migrati hedef aracılığıyla, Thirdveya çoğalması farklar doğrudan olmayan mutant ile karşılaştırıldığında ya da tek taraflı electroporations seçilir ise kontralateral tarafı kontrol edilebilir. Öte yandan, IUE promotör-tahrikli cre / lox kaynaklı ifade zamanlaması ve belirli bir alanda, hücrelerin sadece bir alt gen sentezleme modelinin bir mozaik tür lider hedeflenmektedir doğruluğunu sahip değildir.
Kararlı, tohum çizgisi transgenik kemirgen en önemli avantajı, göz ardı edilebilir, böylece erişkin kemirgenlerde birçok deneysel uygulamalar için, bir beyin bölgesinde hücre sınırlı sayıda geçici transfeksiyon yeterli, ya da arzu edilen olabilir. Aslında, İEÜ bazı anormal gelişmiş hücreler hücreleri veya devrenin tüm ağı etkileyebilir olup olmadığını araştırmak için yararlıdır. Diğer bir avantajı nedeniyle hit mozaik doğaya bir genin olmayan bir hücreye otonom etkilerini göstermek için yeteneği olabilir. Ayrıca, transgenik ve nakavt farelerin üretimi emekleme ve hala kullanımdaanormal beyin gelişimi sonuçları incelemek için bu türün İEÜ yüksek ilgi olduğunu.
Şimdiye kadar, bu gibi yetişkin hayvanlarda müdahale sonuçlarını inceleyen İEÜ kullanmanın önemli bir engel izleme elektroporasyon başarı eksikliğidir. Şimdiye kadar, canlı Yenidoğan sıçan yavrularının uygun bir binoküler flöresanlı bir mikroskop altında ya da IVIS Spectrum floresan görüntüleme ile tespit edilemedi floresan nöronlar GFP-ko-transfekte edildi.
Bu engeli aşmak için, bir lusiferaz raportör geni ile ko-transfekte IUE beyin bölgesinin 3 boyutlu (3D) miktar ölçümleri ile yavruların biyoluminesans canlı görüntüleme gerçekleştirilir.
Nöro genetik manipülasyonu, sıçan embriyo lateral ventrikül içine, insan DISC1, lusiferaz ve GFP ihtiva eden plasmidlerin bir birlikte-enjeksiyon test sonraki bir fonksiyonel deneyde bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermek için bir örnek olarak <subir cımbız elektrot ile elektroporasyon, ardından p> 3 uygulandı. Floresan sinyalleri in vivo doğum sonrası aşamada tespit edilememiştir da, ko-transfekte lüsiferaz geni ile lusiferin metabolizmasından elde edilen katı bir biyoışıldama sinyal doğumdan sonraki beş hafta kadar saptandı. Yetersiz veya yanlış elektroporasyon ile yavrular İEÜ hayvanların atamasını sağlayan, böylece, baştan belirlenen (ilgi gen ve kontrol şifreli) düşük değişkenlik eşleşti elektropore beyin alanları ile deneysel grupta edildi sayede elektroporate beyin alanı izin nicelikleme 3D ölçümleri . Davranışsal paradigmalar yetişkin İEÜ farelerin kullanımı bu protokolün kullanışlılığı bir örnek olarak gösterildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çalışmamız IUE nöronların beyin seçici bir alanda bir transgen ifade eden ve bu müdahalesinin bir sonucu olarak, bu hayvanlar yapılan manipülasyon işlevselliğini gösteren davranış değişiklikleri gösteren yetişkin fareler üretmek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada, bir örnek olarak, prefrontal kortekste küçük bir kısmında, tek taraflı DISC1 aşırı ifade eden fareler amfetamin karşı aşırı duyarlılık (Şekil 9) göstermektedir.
In vivo görüntüleme biyolüminesans ile elektroporasyon başarı için fareler seçme IUE hücre transfeksiyon doğal değişkenlik kontrol edilmesinde etkili olduğu ve daha sonraki incelemeler için düşük denekler arası değişkenlik homojen IUE alana sahip gruplar elde etmek için uygulanmıştır.
Bu çalışmada, biz Tho bile, yeni doğan hayvan ko-elektroporate GFP-uyarılan floresan tespiti ile çöp itibaren Electroporated yavrular seçmek koyamadıköf, aynı zamanda ve aynı hayvanda eşit eş elektroporate lusiferazın bir biyoışıldama sinyal luciferase enjeksiyon (Şekil 6) sonra tespit edilebilir, ve nöronlar ifade GFP altı aylık yaşta hala beyin mevcuttu. Biz, sıçan, lusiferaz / lusiferin Reaksiyon başarılı elektroporasyona beyinleri ile hayvanlar (Şekil 3) ayırt etmek için çok uygun olduğu sonucuna varılmıştır.
IUE başarı kantitatif kontrolü aynı maruz kalma süresi (Şekil 3) içinde fotonların sayısı ile ölçülür ve ortak tanımlanmış lusiferaz enzimatik aktivitesine karşılık gelir biyoışıldama sinyalinin gücü ile ilgilidir. Küçük biyoışıldama sinyalleri 6 aylık sıçan beyninde histolojide ~ 1×10 4 fotonlar / sn / cm 2 / steradyan göstermek 1,000-2,000 GFP-boyanmış hücrelerin bir parlaklık ile, foton sayıları 100-200 tarafından saptanabilen ve. Yüksek sinyal dispbir ışıltısını koydu ~ 5×10 6 fotonlar / sn / cm 2 / steradyan ve ~ 64.000 sayıları kadar.
Kullanılan Sprague Dawley fare suşu olarak, artan yaşla birlikte uzunlamasına biyoışıldama sinyalin zayıflamasına gözlenen ve sinyal P35 yaşına (Şekil 4) ötesine kayboldu. Bu noktada, lusiferazın geçici, plazmid vektör tabanlı ekspresyon ya da azaltır, ve biyoışıldama sinyal nedeniyle artan beyin kitle, veya her ikisi de yok olan sinyal için nedenleri için zayıfladıkça olup olmadığını bilmek yoktur. Yetişkin farelerde, bu fonksiyonel deneyi için, davranış çalışmaları için seçim sadece sinyalin yere göre yapılan, ancak bio-sinyal gücüne göre edildi.
3D niceliksel biyolüminesans izlenmesi farklı elektroporate alanlarda (Şekil 5) arasındaki farklılaşma izin olsa da, onun titizlikle derinlik kuruş bulunan hücreler için sınırlıBeynin nsion. Şekil 6 2D ve 3D resimde biyoışıldama ölçüm elektroporasyon iyi bir konumlandırma belirtilen bir hipokampal elektroporasyon bir örneğini göstermektedir. Parçalara ölüm sonrası beyinde, bir GFP floresans sinyali hipokampusun doğru hedefleme gösteren, biyoışıldama sinyali ile aynı konumu hakkında tespit edildi. Ama histoloji gösterileri de hipokampus korteks dorsal hücreler (Şekil 7) hedef olmuştu. Bu biyoışıldama deney olumlu, İEÜ yavrular tespit etmek ve aynı zamanda Electroporated alanının bir fikir var, ama, sonuçta, görüntüleme tam olumlu hedeflenen hücrelere lokalize otopsi histoloji yerini alamaz yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.
Bizim gösteri c sapmaları simülasyonu hipokampal, kortikal ya da beyin bölgelerinin ince hedef manipülasyonlar oluşturmak için IUE teknolojinin uygulanması için söz gösterirortical göç veya yetişkin hayvan etkileyebilecek diğer nörogelişimsel kusurlar. İkili elektroporasyon 26 davranışı üzerinde olası bir daha büyük bir etki avantajına sahip olmakla birlikte, embriyoların daha fazla ölüm oranı da vardır. Tek taraflı tek taraflı bir elektroporasyon, küçük bir bölgede daha IUE manipulasyon davranışı değiştirmek için yeterli olduğunu göstermek için bir iç kontrol olarak tek, hem de sahip iki hemisfer karşılaştırmak amacıyla seçildi. Nöronlar arasındaki bağlantı ya da mimari IUE kaynaklı değişimler, uygun bir davranış testi ile bir lezyon ve-olduğu-IUE-manipüle bölgenin istenen maç uyandırma olmadan indüklenebilen bilimsel söz bağlıdır.
Sorun giderme
İndirimli DKBKS İEÜ yavruların hayatta artan ilgili çeşitli öneriler vardır. İlk olarak, elektroporasyon sırasında çok ince cam kılcal damarların kullanılması doku lesio en aza indirmek amacıylan tavsiye edilir. İkincisi, her uterus boynuzu vajinal sonunda ilk embriyo electroporate yok: ilk doğan embriyonun ölümü diğer tüm embriyoların bir iptale şansını artırır. Üçüncü olarak, doğumdan sonra, anne fareler nedeniyle sık sık perinatal stres onların döl kısmını öldürür. Ek stresi azaltmak için, doğumdan hemen sonra canlı görüntüleme ile başlar, ama yedi gün boyunca bekleyin.
Yavruların-GFP floresans saptama
Bir hafta doğumdan sonra, IVIS Spektrum canlı binoküler floresan mikroskopik görüntüleme veya floresan görüntüleme kullanarak ya floresan sinyal (epifluorışıma ve transfluorescence modları; GFP uyarma / emisyon için: 465/520 nm ve 500/540 nm). Bu, derinin kafatası ve yüksek otofloresan arka plan gibi doku ile kısa dalga boyu uyarım ve emisyon ışık iletimi sınırlı azalan altında floresan kullanarak engellemek hem de mümkündürSıçan koşulları ribed. Şekil 6'da gösterildiği gibi, canlı bir hayvanda lusiferaz sinyali de (kafatası olmadan) kesilir beyinde tespit edilebilir ve burada, aynı zamanda, bir floresan sinyali (Şekil 6D) tespit edilebilir.
Yakından aralıklı beyin bölgelerinde biyolüminesensin Farklılaşma
Hatta 3D resimde biyoışıldama alanının konumu% 100 tahmin edilemez. Ya da tahmin edilen alanın altında üstünde özellikle hücreler de yanlışlıkla hedef ve transfekte edilebilir. Kesin konum (bkz. Şekil 7) ölüm sonrası (floresans) histoloji tarafından kontrol edilmelidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar plasmidlerini sağlamak için Tracy Young-Pearse'nin ve Atsushi Kamiya teşekkür ederim.
CK, ve MASS (DE 792/2-4); Bu çalışma OR ve CK (Bmbf 01EW1003), DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) için NEURON-ERANET keşfetmek tarafından finanse edildi
Materials
| Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
| kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
| Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
| IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).
- Takahashi, M. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155 (2002).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J Comp Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Young-Pearse, T. L., et al. A critical function for beta-amyloid precursor protein in neuronal migration revealed by in utero RNA interference. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 27, 14459-14469 (2007).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Sapir, T., et al. Accurate balance of the polarity kinase MARK2/Par-1 is required for proper cortical neuronal migration. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 5710-5720 (2008).
- Weinberger, D. R. From neuropathology to neurodevelopment. Lancet. 346, 552-557 (1995).
- Murray, R. M., Lewis, S. W. Is schizophrenia a neurodevelopmental disorder?. British Medical Journal. 295, 681-682 (1987).
- Kamiya, A., et al. A schizophrenia-associated mutation of DISC1 perturbs cerebral cortex development. Nat Cell Biol. 7, 1167-1178 (2005).
- Miyoshi, K., et al. Disrupted-In-Schizophrenia 1, a candidate gene for schizophrenia, participates in neurite outgrowth. Mol Psychiatry. 8, 685-694 (2003).
- Mao, Y., et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation via modulation of GSK3beta/beta-catenin signaling. Cell. 136, 1017-1031 (2009).
- Millar, J. K., et al. Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia. Hum Mol Genet. 9, 1415-1423 (2000).
- Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 738-745 (2012).
- Niwa, M., et al. Knockdown of DISC1 by in utero gene transfer disturbs postnatal dopaminergic maturation in the frontal cortex and leads to adult behavioral deficits. Neuron. 65, 480-489 (2010).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In utero electroporation as a tool for genetic manipulation in vivo to study psychiatric disorders: from genes to circuits and behaviors. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry 18. , 169-179 (2012).
- Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6, 1277-1283 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Development, Growth & Differentiation. 41, 335-344 (1999).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).
- Featherstone, R. E., Kapur, S., Fletcher, P. J. The amphetamine-induced sensitized state as a model of schizophrenia. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatry. 31, 1556-1571 (2007).
- Pum, M., Carey, R. J., Huston, J. P., Muller, C. P. Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats. Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).
- dal Maschio, M., et al. High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe. Nature Communications. 3, 960 (2012).
