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Neuroscience

Generazione di topi transgenici per uso topico<em> In utero</em> Elettroporazione e<em> In vivo</em> Screening bioluminescenza

Published: September 24, 2013
doi:
10.3791/50146
, , , ,
1Department of Neuropathology,Medical School Düsseldorf, 2Department of Molecular Genetics,Weizmann Institute for Science, 3Center of Behavioral Neuroscience,University of Düsseldorf

Summary

I geni possono essere manipolati durante lo sviluppo della corteccia o nell'ippocampo di ratto mediante elettroporazione in utero (IUE) a E16, per permettere modifiche rapide e mirate in termini di connettività neuronale per gli studi successivi di comportamento o neuropatologia negli animali adulti. Postnatale imaging in vivo per il controllo di successo IUE è eseguita da bioluminescenza di attivare luciferasi co-trasfettate.

Abstract

Elettroporazione in utero (IUE) è una tecnica che permette di modificazione genetica delle cellule del cervello per studiare lo sviluppo neuronale. Finora, l'uso di IUE per indagare il comportamento o neuropatologia nel cervello adulto è stato limitato dai metodi insufficienti per il monitoraggio della IUE successo trasfezione con tecniche non invasive negli animali post-natale.

Per il presente studio, ratti E16 sono stati usati per IUE. Dopo l'iniezione intraventricolare degli acidi nucleici nei embrioni, il posizionamento degli elettrodi pinzetta era critica per il targeting o la corteccia di sviluppo o dell'ippocampo.

Ventricolare co-iniezione ed elettroporazione di un gene luciferasi permesso un monitoraggio delle cellule trasfettate postnatally dopo l'iniezione luciferina intraperitoneale nel anestetizzato P7 vivo cucciolo da bioluminescenza in vivo, utilizzando un dispositivo Spectrum IVIS con software 3D quantificazione.

<pclass = "jove_content"> Definizione Area di bioluminescenza poteva chiaramente distinguere tra electroporations corticali e dell'ippocampo e rilevare un segnale longitudinalmente nel corso del tempo fino a 5 settimane dopo la nascita. Questa tecnica di imaging permesso di selezionare cuccioli con un numero sufficiente di cellule trasfettate assunte necessaria per innescare effetti biologici e, successivamente, effettuare indagini comportamentali alle 3 mese di età. Come esempio, questo studio dimostra che IUE con la lunghezza gene DISC1 umano nella corteccia di ratto hanno portato a anfetamine ipersensibilità. GFP cotrasfettate potrebbe essere rilevato in neuroni di post mortem microscopia a fluorescenza in criosezioni indicanti l'espressione genica presente alla ≥ 6 mesi dopo la nascita.

Concludiamo che postnatale di imaging bioluminescenza consente di valutare il successo di trasfezioni transienti con IUE nei ratti. Indagini sull'influenza di manipolazioni genetiche topici durante neurodevelopment sul cervello adulto e la sua connettività è notevolmente facilitato. Per molte questioni scientifiche, questa tecnica può integrare o addirittura sostituire l'uso di topi transgenici e fornire una nuova tecnologia per le neuroscienze comportamentali.

Introduction

Lo sviluppo della elettroporazione in utero metodo (IUE) che permette una modulazione dell'espressione genica nel cervello di sviluppo, è stato un break-through, dato che consente studiando neurodevelopment con relativa facilità. 1-7 variazioni dei livelli di espressione di un gene bersaglio in una regione specifica del cervello durante lo sviluppo embrionale e / o perinatale nei roditori sono stati dimostrato criticamente influenza la proliferazione neuronale, migrazione, arborization, e la connettività. 8-10

La schizofrenia è una malattia mentale complesso con sintomi acuti e cronici che si è legati ad anomalie dello sviluppo neurologico 11, 12 e quindi molti dei geni candidati identificati per la schizofrenia sono indagati per i potenziali effetti modulanti sui neurosviluppo, come ad esempio per il interrotto-in-schizofrenia -1 (DISC1) gene 13-15.

Lo sviluppo del cervello è regulatEd da fattori genetici e le loro interazioni con l'ambiente che svolgono ruoli nella pre-, periodi di sviluppo peri-e postnatale. Un importante fattore di rischio genetico per vari disturbi comportamentali è il DISC1 16 gene. DISC1 porta atterramento di difetti di migrazione nei topi 13, 17, e la manipolazione di espressione DISC1 nella corteccia di sviluppo da IUE ha dimostrato di influenzare il comportamento di topi adulti 18.

Manipolazione genica cervello IUE ha diversi vantaggi 19 durante la generazione di linee di animali transgenici. In primo luogo, l'espressione genica all'interno di aree di interesse si ottiene nel giro di settimane o mesi, piuttosto che diverse generazioni di allevamento linee di roditori transgenici. In secondo luogo, si evitano meccanismi di compensazione durante lo sviluppo precoce che possono schermare fenotipi in linea germinale-ingegneria animali 20. Terzo, indirizzando solo una popolazione cellulare specifica o determinata area del cervello, migratio differenze di proliferazione possono essere confrontati direttamente con la non-mutante o controllare lato controlaterale se si scelgono electroporations unilaterali. D'altra parte, IUE non ha l'accuratezza di temporizzazione CRE promotore-driven / lox indotta di espressione e solo una sottopopolazione di cellule in una certa area è mirata portando ad una sorta di mosaico pattern di espressione genica.

Per molte applicazioni sperimentali in roditori adulti, una trasfezione transiente di un numero limitato di cellule in una regione del cervello può essere sufficiente, o addirittura desiderato, in modo che il principale vantaggio di roditori, stabili germinali transgenico è trascurabile. Infatti, IUE è utile verificare se alcune celle anormalmente sviluppati possono influenzare una intera rete di cellule o circuiti. Un altro vantaggio può essere la capacità di dimostrare effetti non cellule autonomo di un gene causa della natura mosaico del colpo. Inoltre, la generazione di topi transgenici e knockout è ancora nella sua infanzia e l'usodi IUE in questa specie per studiare aberranti conseguenze per lo sviluppo del cervello è di grande interesse.

Finora, uno dei principali ostacoli di utilizzo IUE per indagare le conseguenze di intervento in tali animali come gli adulti è la mancanza di successo di monitoraggio elettroporazione. Finora, GFP-co-trasfettate neuroni fluorescenti in diretta cuccioli di ratto appena nati non potevano essere rilevati con un microscopio a fluorescenza binoculare adatto o con l'imaging di fluorescenza del IVIS Spectrum.

Per superare questo ostacolo, ci cotrasfettate un gene reporter luciferasi e svolta bioluminescenza imaging dal vivo di cuccioli da 3 dimensioni (3D) quantificazione della zona del cervello IUE.

Come esempio per dimostrare l'applicabilità di questo metodo in un saggio funzionale di provarne la manipolazione genetica sviluppo neurologico, un co-iniezione di plasmidi contenenti DISC1 umano, luciferasi, e GFP nel ventricolo laterale di embrioni di ratto <sup> 3 seguito da elettroporazione con un elettrodo pinzetta stata eseguita. Mentre segnali di fluorescenza non potevano essere rilevati in fasi postnatali in vivo, un segnale di bioluminescenza solido derivato dal metabolismo luciferina mediante co-trasfettate gene della luciferasi è stato rilevato fino a cinque settimane dopo la nascita. 3D-misure della zona del cervello quantificazione permesso elettroporato cui cuccioli con elettroporazione insufficiente o fuori luogo sono stati identificati sin dall'inizio, quindi, consentendo l'assegnazione degli animali IUE (gene di interesse e strapazzate controllo) per gruppi sperimentali con le aree del cervello elettroporate abbinati a bassa variabilità . L'uso di ratti adulti IUE in paradigmi comportamentali è stata dimostrata come esempio dell'utilità di questo protocollo.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati autorizzati dalla Landesministerium responsabile für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301), in conformità con la legislazione nazionale ed europea. 1. Elettroporazione in utero Questo metodo è stato descritto in dettaglio in JoVE per il ratto Walantus et al. 3, nonché Rice et al. 4 ed è qui riassunte brevemente. Una dimensione cucciolata di 6-8 cuccioli produce un buon risultato. Ci dovrebbe essere almeno due embrioni non elettroporate al fine di aumentare il tasso di sopravvivenza globale (vedi sotto). Preparare DNA-Miscela contenente 1,5 mg / mL di target-plasmidi (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 sovraespressione: pCAX 21), 0.5 mg / mL Luciferase contenenti plasmidi (pCAX), 0.5 mg / mL GFP contenenti plasmide (pCAGGS 22) in 1x PBS soluzione macchiato blu chiaroe con Fast verde Dye. Preparare aghi da iniezione di capillari di vetro con un ago Pipetta Puller. E sterilizzare strumenti chirurgici sia in autoclave o incubazione con un disinfettante a base di alcool (kodan Tinktur forte). Somministrare una dose pre-operatoria di buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 min prima di un intervento chirurgico per un topo incinta 16 giorni dopo la fecondazione (E16). Poi anestetizzare l'animale in una camera isoflurano. Su anestesia, collocare il ratto in posizione supina su un tavolo operatorio 37 ° C-riscaldato con maschera di respirazione collegato al dispositivo di anestesia, usando impostazione ossigeno a 0,4 L / min e isoflurano al 1,8%. Dopo la rasatura l'addome, disinfettare la zona rasata tre volte con kodan Tinktur Forte (un disinfettante a base di alcool). Coprire il ratto con panni sterili, esponendo solo il campo di funzionamento rasata. Eseguire elettroporazione in utero. Tagliare l'addome con un scissor lungo la linea alba (circa 2 cm). Esporre attentamente le corna uterine con una pinza ad anello. Fate attenzione a mantenere la parete dell'utero bagnato con PBS sterile riscaldato durante tutto l'intervento chirurgico. Iniettare soluzione di DNA con un ago di vetro sottile in uno del ventricolo laterale degli embrioni. Posizionare l'elettrodo 7 millimetri intorno alla testa dell'embrione. Per colpire una popolazione cellulare di strati corticali superiori, eseguire l'IUE a E16 23 e posizionare l'elettrodo positivo sul semisfera sopra il ventricolo iniettati con una leggera tendenza dorsale / laterale. Per indirizzare le cellule ippocampali cambiare il posizionamento dell'elettrodo positivo sul lato opposto rispetto al ventricolo iniettato con laterale a leggermente direzione dorsale (Figura 1). Eseguire elettroporazione da cinque a 50 impulsi msec a 55 V con 950 interruzioni msec con un quadrato dell'onda di polso elettroporatore. Pezzi primo embrione alla fine di ogni vaginale corno dell'utero per aumentare tha possibilità di sopravvivenza di tutti gli embrioni. Mettere le corna utero indietro nel ratto madre. Stich la parete addominale con un Vicryl materiale assorbibile sutura chirurgica. Chiudere la pelle con il materiale di sutura Vicryl o con suture. Posizionare il topo madre nella gabbia di casa e tenerlo al caldo per 2-3 ore. Tenere solo i topi nella loro gabbia casa nella sala stabulario e dei mangimi ad libitum. Essi danno vita tra E22-24. Mantenere i cuccioli di ratto con la madre per tre settimane e separarli successivamente per sesso. 2. Bioluminescenza Immagini dal vivo della reazione enzimatica Luciferase Questo metodo viene utilizzato per analizzare la posizione delle cellule trasfettate in utero. Co-elettroporate cDNA luciferasi di lucciola è tradotto in luciferasi attiva, che su di metabolizzare D-luciferina a oxyluciferin, emette un fotone (Figura 2 </strong>). La luminescenza risultante può essere rilevato nel cervello di ratti giovani elettroporate positivi in un Spectrum IVIS fino all'età di circa 35 giorni dopo la nascita (Figura 4). Nel presente studio, la rappresentazione luciferasi saggio e bioluminescenza è stata effettuata a partire P7. Questo punto di tempo è stato scelto per permettere madre e cuccioli di recuperare dallo stress nascita. Quando si lavora inizialmente con i cuccioli a P0, sopravvivenza della prole è stata gravemente colpita dal fatto che i cuccioli sono stati trovati morti o mangiati dalla madre. Inizialmente, i cuccioli di ratto con l'elettroporazione di successo sono identificati da una foto 2D bioluminescenza, con un tempo di esposizione di tre minuti. Successivamente, cuccioli positivi vengono utilizzati per la creazione di immagini in 3D per specificare la posizione della zona elettroporate. Diluire sale sodico D-luciferina in PBS ad una concentrazione di 15 mg / ml e sterilizzare per filtrazione con un filtro a siringa sterile. Pesare i cuccioli. Prendere il cucciolo in una mano con l'addome sulla parte superiore e allungare l'addome leggermente. Iniettare 10 ml / g di peso corporeo di luciferina soluzione intraperitoneale. Per i più anziani e più agili, pre-anestetizzare i cuccioli con isoflurano nella camera di induzione prima di iniettare il luciferina. Accendere l'afflusso isoflurano del XGI-8 Gas anestesia sistema all'interno della Spectrum IVIS con il 3% isoflurano. Mettere il muso dell'animale nei coni naso di vetro del sistema di anestesia. Tenere l'animale in posizione prona finché è in anestesia profonda (2-3 min). Quindi ridurre l'afflusso isoflurano al 1,5%. Scegli una misurazione 2D-bioluminescenza per selezionare cuccioli positivi da tutta cucciolata. Utilizzare le seguenti impostazioni Clicca qui per ingrandire la figura . Impostare un checkmark sulla Fotografia con binning media e F / Stop alle 8, la fotocamera scatta una foto dall'alto dopo aver iniziato la misurazione. Set filtro di eccitazione: block. Set filtro per le emissioni: aperta. Impostare binning medio. Set F / Stop a 1. Impostare il livello di Fase A. Impostare luminescenza tempo di esposizione di 180 sec. Per la creazione di immagini in 3D al fine di quantificare meglio la zona elettroporato dai cuccioli positivi, utilizzare le seguenti impostazioni DLIT per la luciferasi di lucciola. Clicca qui per ingrandire la figura . Impostare un segno di spunta sulla fotografia, la fotocamera scatta una foto dall'alto dopo aver iniziato la misurazione. Impostare un segno di spunta sulla struttura, la superficie dell'animale viene analizzata dal IVIS prima della misurazione bioluminescenza. Use a seguito di emissione filtri e le impostazioni tempo di esposizione fino all'età di due settimane: Filtro per le emissioni 1: 590 nm, tempo di esposizione 300 sec Filtro per le emissioni 2: 600 nm, tempo di esposizione 240 sec Filtro per le emissioni 3: 620 nm, tempo di esposizione 180 sec Filtro di emissione 4: 640 nm, tempo di esposizione 120 sec Per i topi di età superiore a P20 1 filtro di emissione: 600 nm, tempo di esposizione 300 sec Filtro per le emissioni 2: 620 nm, tempo di esposizione 300 sec Filtro 3 di emissione: 640 nm, tempo di esposizione 300 sec Clicca qui per ingrandire la figura . A causa della diminuzione della potenza del segnale in animali più vecchi, il tempo di esposizione è ingrandita per i tre filtri migliori emissione. Impostare il livello di Fase B Impostare binning medio. Set F / Stop a 1 Dopo la misurazione, mar k i ratti da un codice earhole per differenziarli l'uno dall'altro e di abbinarli alle tabelle IVIS Imaging Live Al termine della procedura di misurazione, spegnere isoflurano afflusso e mantenere il ratto sul piatto riscaldato per alcuni minuti prima di tornare alla sua gabbia. 3. Analisi della bioluminescenza Immagini La generazione di immagini 3D, film 3D e la quantificazione del volume della sorgente del segnale è effettuata dal software Living Immagine preinstallato sul IVIS Spectrum. Generazione di immagini 3D In primo luogo, ricostruire una topografia superficiale, quindi impostare soglia tra 20-30%. Clicca qui per ingrandire la figura . een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> Inizia DLIT ricostruzione 3D con una soglia di immagine di 10% per ogni lunghezza d'onda. Clicca qui per ingrandire la figura . Clicca qui per ingrandire la figura . Clicca qui per ingrandire la figura . Crea film in 3D utilizzando il pulsante animato all'interno della barra degli strumenti 3D. Scegliere diversi orientamenti del 3D, così come lo zoom di vista come fotogrammi chiave e premere il tasto 'Record & #39; pulsante, registrando il passaggio da una posizione / orientamento a un altro. Clicca qui per ingrandire la figura . 4. Test comportamentale Test comportamentali è stata effettuata al fine di determinare se le manipolazioni genetiche IUE-mediate nel ratto potrebbero iniziare effetti a lungo termine che persistono in età adulta. Nel caso particolare, l'effetto di transitorio, unilaterale piena lunghezza DISC1 umano corticale sovraespressione dopo IUE è stato studiato testando locomozione in un campo aperto (OF), con e senza una bassa dose di anfetamina, come un test specifico per la dopamina relativi comportamenti 24. In una procedura simile esercitata da Niwa et al. Nei topi IUE utilizzando DISC1 smontabile, topi IUE ma non controlli hanno mostrato ipersensibilitàall'anfetamina 18. Ratti che sono stati in utero elettroporazione con un DISC1 iperespressione vettore si sono svolte in condizioni di laboratorio con la luce 12 ore 07:00-7:00 e sono stati alimentati ad libitum. A 3 mesi di età, i ratti sono stati sottoposti a test comportamentali. Per quantificare la locomozione come un visualizzatore di effetti anfetamine, un campo aperto di un sistema di attività Tru Scan situato in una camera di suono e luce-isolato è stato utilizzato. Questo sistema misura la durata e la distanza l'animale si muove, il tempo e la distanza trascorsi in margine o al centro del campo aperto, così come l'allevamento di comportamento 25. Il primo giorno, prova dopo l'iniezione di soluzione salina Pesare gli animali. Iniettare per via intraperitoneale 1 ml / g di peso corporeo di una soluzione salina (PBS 1x). Subito dopo l'iniezione, la soppressione dell'animale nel campo aperto ed avviare la misura del sistema TruScan. Record per 15 minuti und suddividere i dati in 3 x 5 min parti. Mettere l'animale di nuovo nella sua gabbia casa. Secondo giorno, test di iniezione anfetamine Pesare gli animali. Iniettare per via intraperitoneale 1 ml / g di peso corporeo di un / soluzione anfetamine ml 0,5 mg. Subito dopo l'iniezione soppressione dell'animale nel campo aperto e avvia la misura del sistema TruScan. Record per 15 min e suddividere i dati in 3 x 5 min parti. Rispedire l'animale verso la sua gabbia casa. Analizzare locomozione e comportamento allevamento generato dal software specifico Tru Scan. Creare grafici con GraphPad (Prism) e calcolare le statistiche dal software SPSS Statistics.

Representative Results

La figura 3 mostra dal vivo le misure di imaging di tre cuccioli di ratto al P7 dopo l'iniezione di 150 mg luciferina / kg di peso corporeo. Differenze di potenza del segnale che indicano la variabilità nella efficienza del IUE sono visibili. Segnali bioluminescenza forti sono stati registrati fino P36 (Figura 4). Nella Figura 5, la capacità di definire corticale (Figure 5A e 5C) e dell'ippocampo (figure 5B e 5D) elettroporazione da imaging bioluminescenza sono raffigurati. Correlazione del segnale di bioluminescenza (Figura 7A) con il suo segnale di fluorescenza dopo la rimozione del cranio (Figura 7B) e le corrispondenti cellule GFP-elettroporate nel cervello cryosectioned (Figura 8) a P14 sono rappresentati nelle Figure 6-8. Di nota, non c'era rilevazione di un segnale di fluorescenza in ratti vivi in ​​qualsiasi punto nel tempo. tenda "> In vivo bioluminescenza consente discriminazione approssimativa di differenti aree del cervello elettroporate da 2D (Figure 5A e 5B) che è notevolmente migliorata con il programma DLIT del software Spectrum IVIS generando immagini 3D (Figure 5C e 5D). Negli esempi mostrati , elettroporazione della corteccia prefrontale e ippocampo potrebbe essere distinto. Occorre notare che mentre mira a elettroporazione l'ippocampo, alcune cellule progenitrici per la corteccia sdraiata dorsale dell'ippocampo possono anche essere colpiti (Figura 7). Rats unilateralmente in utero elettroporate con pCAX vettore nella corteccia e successivamente che iperesprimono piena lunghezza DISC1 umano sono stati studiati sia per la spontanea e iperattività anfetamine indotta da adulti. Ratti elettroporate con pCAX-DISC1 sono ipersensibili a una bassa dose di anfetamina. Questi ratti spostato significativamente more dopo il trattamento anfetamine che dopo di iniezione salina, mentre gli animali di controllo non ha (Figura 10). Figura 1. Schema della posizione degli elettrodi per A) corteccia elettroporazione e B) elettroporazione ippocampale; verde = iniettato DNA-Mix all'interno del ventricolo. Figura 2. Reazione Luciferase. Figura 3. Misurazione luminescenza di ratti P7 dopo l'iniezione di 150 mg / kg di peso corporeo luciferina, tempo di esposizione 180 sec; A) ratto senza segnale luminescente; B) ratto con un segnale di bioluminescenza debole C) ratto con un segnale forte luminescenza. Figura 4. Linea temporale delle misure di bioluminescenza consecutive dello stesso ratto dopo iniezione di 150 mg / kg luciferina dimostrando una finestra temporale in cui grande successo IUE può essere rilevato. . Figura 5 Illustrazione delle differenze tra elettroporazione corticale e ippocampale a P7 A) e B) immagini 2D;. C) e D), le immagini in 3D, A) e C) da corteccia, B) e D) da ippocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Clicca qui per ingrandire la figura. Figura 6. Illustrazione di E16 elettroporazione ippocampale di un cucciolo di ratto a P14 A) 2D-picture di bioluminescenza B) Illustrazione 3D del segnale C bioluminescenza) sezionato il cervello con il segnale di bioluminescenza D) cervello con GFP segnale epi-fluorescenza. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 7. Dettaglio di un'immagine fluorescenza da una sezione crio 20 micron dello stesso P14 ratto cervello elettroporate con GFP contenenti plasmide e luciferasivettore, nuclei colorazione con DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro dentato, FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Animazione 3D di un ippocampo elettroporata ratto a P14. Figura 8. Sistema di prove Amphetamine: iniezione di soluzione salina primo giorno prima della prova di 15 min, 24 ore dopo l'iniezione di anfetamine prima della prova nella camera di campo aperto. Figura 9. Prova Amphetamine. Grafico a barre che mostra la distanza spostato (in cm) dell'animale registrato da un sistema TrueScan oltre 15 min barre bianche = gruppo di controllo;. Barre grigie = DISC1 gruppo sovraespressione; gruppo di controllo n = 10; DISC1 gruppo sovraespressione n = 11; ANOVA: Geno * trattamento p = 0.043; T-Test per il tempo salino totale vs ns anfetamine = non significativo pCONTROL = 0,172, pDISC1 = 0.001.

Discussion

Il nostro studio dimostra che IUE è adatto per generare ratti adulti con neuroni esprimono un transgene in una zona selettiva del cervello e che, come risultato di questo intervento, questi animali mostrano cambiamenti nel comportamento indica funzionalità della manipolazione eseguita. In questo studio, come esempio, ratti overesprimono DISC1 unilateralmente in una piccola parte della corteccia prefrontale mostrato ipersensibilità verso anfetamina (Figura 9).

Selezione dei ratti per l'elettroporazione successo in vivo bioluminescenza è stato efficace nel controllare la variabilità intrinseca della transfezione delle cellule IUE ed è stata applicata per generare i gruppi con una superficie IUE omogenea di bassa variabilità inter-soggetto per le indagini successive.

In questo studio, siamo stati in grado di selezionare cuccioli elettroporati dalla cucciolata dalla rilevazione della fluorescenza GFP-indotta co-elettroporate in animali appena nati, anche though allo stesso tempo e nello stesso animale un segnale di bioluminescenza della luciferasi ugualmente co-elettroporate potrebbe essere rilevato dopo l'iniezione luciferina (Figura 6), e la GFP che esprimono neuroni erano ancora presenti nel cervello in età di sei mesi. Concludiamo che, nel ratto, la reazione luciferasi / luciferina è adatto per differenziare animali con cervelli elettroporate successo (Figura 3).

Il monitoraggio quantitativo del successo IUE relativo alla resistenza del segnale di bioluminescenza che viene misurata dai conteggi di fotoni entro lo stesso tempo di esposizione (figura 3) e corrisponde all'attività enzimatica di co-espressi luciferasi. Piccoli segnali bioluminescenza sono rilevabili da 100-200 conteggi di fotoni, e, in un fulgore di ~ 1×10 4 fotoni / sec / cm 2 / spettacolo steradiante 1000-2000 cellule GFP-tinto in istologia in 6 mesi cervello di ratto. La massima disp segnalearredare una luminosità fino a ~ 5×10 6 fotoni / sec / cm 2 / steradiante e ~ 64.000 conteggi.

Nel ceppo ratto Sprague Dawley usato, abbiamo osservato un indebolimento del segnale di bioluminescenza longitudinalmente con l'età e il segnale scomparve oltre l'età di P35 (Figura 4). A questo punto, non sappiamo se sia transitorio, plasmide di espressione basati su vettori di luciferasi diminuisce, o se il segnale di bioluminescenza si indebolisce a causa della crescente massa cerebrale, o entrambi sono le cause della scomparsa del segnale. Per il saggio funzionale presente nei ratti adulti, la selezione per studi comportamentali stava semplicemente fatta in base alla posizione del segnale, ma non con la forza del segnale di bioluminescenza.

Anche se il monitoraggio bioluminescenza quantitativa 3D permesso differenziazione tra ambiti elettroporate (Figura 5), sua precisione era limitata per cellule situate nel dime profonditànsion del cervello. Figura 6 mostra un esempio di elettroporazione dell'ippocampo in cui la misura bioluminescenza in 2D e l'immagine 3D indicato un buon posizionamento del elettroporazione. Nel cervello post mortem sezionato, un segnale GFP-fluorescenza è stata rilevata a circa la stessa posizione del segnale di bioluminescenza, indicando corretto orientamento dei dell'ippocampo. Ma mostra istologici che anche cellule nella corteccia dorsale dell'ippocampo erano stati mirata (Figura 7). Ciò indica che il saggio di bioluminescenza è uno strumento utile per rilevare positivi, cuccioli IUE ed anche per avere un'idea dell'area elettroporate, ma, in ultima analisi, imaging non può sostituire mortem istologia post per localizzare esattamente cellule bersaglio positivamente.

La nostra dimostrazione indica promessa per l'applicazione della tecnologia IUE per generare sottili manipolazioni mirate di regioni cerebrali corticali o ippocampali per simulare aberrances in cmigrazione ortical o altri difetti dello sviluppo neurologico che possono influenzare l'animale adulto. Mentre elettroporazione bilaterale 26 presenta il vantaggio di un effetto probabile maggiore comportamento, c'è anche più mortalità di embrioni. Elettroporazione unilaterale stato scelto al fine di confrontare i due emisferi con uno come controllo interno, nonché per mostrare che manipolando IUE in un unilaterale, piccola regione è sufficiente cambiare comportamento. Cambiamenti IUE-indotti nella connettività o architettura tra neuroni possono quindi essere indotti senza evocare una lesione e la partita desiderata della regione a-essere-IUE-regolante con la prova comportamentale appropriata dipende dalla questione scientifica.

Risoluzione dei problemi

Dimensione cucciolata Ridotto Ci sono diversi suggerimenti per quanto riguarda l'aumento della sopravvivenza dei cuccioli IUE. In primo luogo, l'uso di capillari di vetro molto sottili durante elettroporazione per minimizzare lesio tessutoSi raccomanda n. In secondo luogo, non elettroporazione il primo embrione alla fine vaginale di ogni corno dell'utero: la morte dei primogeniti degli embrioni aumenta le probabilità di una interruzione di tutti gli altri embrioni. In terzo luogo, dopo la nascita, i topi madri spesso uccidono parte della loro progenie a causa di stress perinatale. Al fine di ridurre lo stress aggiuntivo, non iniziare con l'imaging dal vivo subito dopo la nascita, ma aspettare per sette giorni.

Rilevamento GFP-fluorescenza dei cuccioli

A una settimana dopo la nascita, nessun segnale di fluorescenza o utilizzando vivo fluorescenza binoculare di imaging microscopico o l'imaging di fluorescenza con la IVIS Spectrum (modalità epifluorescenza e transfluorescence, per GFP eccitazione / emissione: 465/520 nm e 500/540 nm). E 'possibile che sia, la trasmissione limitata di breve lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione di luce attraverso i tessuti come il cranio e il fondo elevato autofluorescenza della pelle impedisce utilizzando fluorescenza sotto la desccondizioni ribed nel ratto. Come mostrato in Figura 6, il segnale luciferasi nell'animale vivo può anche essere rilevata nel cervello sezionato (senza cranio) e lì, anche un segnale di fluorescenza è rilevabile (Figura 6D).

Differenziazione della bioluminescenza in aree cerebrali ravvicinati

Anche nella figura 3D l'ubicazione della zona di bioluminescenza non può essere prevista al 100%. In particolare le cellule sopra o al di sotto della zona predetto possono essere accidentalmente mirati e transfettate. La posizione esatta deve essere controllato da post mortem (fluorescenza) istologia (vedere la Figura 7).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Tracy Young-Pearse e Atsushi Kamiya per la fornitura di plasmidi.

Questo lavoro è stato finanziato dalla NEURON-ERANET DISCover di OR e CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) per CK, e (DE 792/2-4) a MASSA

Materials

Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke & Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors – sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O		 100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

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References

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Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).
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