Génération de rats transgéniques par voie topique<em> In utero</em> L'électroporation et<em> In vivo</em> Bioluminescence dépistage
Summary
Les gènes peuvent être manipulés au cours du développement du cortex ou de l'hippocampe du rat par électroporation in utero (IUE) à E16, pour permettre des modifications rapides et ciblées en matière de connectivité neuronale à des études ultérieures de comportement ou la neuropathologie chez les animaux adultes. Postnatal l'imagerie in vivo pour le contrôle de succès IUE est effectuée par la bioluminescence de l'activation de la luciférase co-transfecté.
Abstract
Électroporation in utero (IUE) est une technique qui permet la modification génétique de cellules dans le cerveau pour étudier le développement neuronal. Jusqu'à présent, l'utilisation de l'IUE pour étudier le comportement ou la neuropathologie dans le cerveau adulte a été limitée par des méthodes insuffisantes pour la surveillance de l'IUE succès de la transfection par des techniques non-invasives chez les animaux postnatales.
Pour la présente étude, des rats ont été utilisés pour E16 IUE. Après l'injection intra-ventriculaire des acides nucléiques dans les embryons, le positionnement des électrodes de la pince était critique pour le ciblage ou l'autre développement du cortex ou de l'hippocampe.
Ventriculaire co-injection et l'électroporation d'un gène de la luciférase a permis la surveillance des cellules transfectées après la naissance, après injection intra-péritonéale de la luciférine dans le P7 direct pup anesthésiés par bioluminescence in vivo, en utilisant un dispositif IVIS spectre avec un logiciel de quantification 3D.
<pclass = "jove_content"> Définition de zone par bioluminescence pourrait distinguer clairement électroporations corticales et hippocampiques et détecter un signal longitudinalement au fil du temps jusqu'à 5 semaines après la naissance. Cette technique d'imagerie nous a permis de sélectionner les chiots avec un nombre suffisant de cellules transfectées assumées nécessaire pour déclencher des effets biologiques et, par la suite, d'effectuer des enquêtes de comportement à trois mois de l'âge. A titre d'exemple, cette étude démontre que IUE avec le gène DISC1 humain de pleine longueur dans le cortex de rat a entraîné une hypersensibilité amphétamine. GFP co-transfectées a pu être détectée dans les neurones post-mortem par microscopie à fluorescence dans cryosections indiquant l'expression des gènes présents à ≥ 6 mois après la naissance.Nous concluons que l'imagerie par bioluminescence postnatale permet d'évaluer le succès de transfections transitoires avec IUE chez les rats. Enquêtes sur l'influence des manipulations génétiques d'actualité pendant neurodevelopment sur le cerveau adulte et sa connectivité sont grandement facilitée. Pour de nombreuses questions scientifiques, cette technique peut compléter ou même remplacer l'utilisation de rats transgéniques et de fournir une nouvelle technologie pour les neurosciences comportementales.
Introduction
Le développement de l'électroporation in utero de procédé (IUE) qui permet une modulation de l'expression des gènes dans le cerveau en développement, a été percée, car il a permis d'étudier le développement neurologique avec une relative facilité. 07.01 variations de niveaux d'un gène cible dans l'expression une région spécifique du cerveau au cours du développement embryonnaire et / ou périnatale chez les rongeurs ont été démontrées de façon critique la prolifération neuronale influence, la migration, l'arborisation, et la connectivité. 8-10
La schizophrénie est une maladie mentale complexe avec des symptômes aigus et chroniques qui ont été liées à des anomalies du développement neurologique 11, 12 et donc un grand nombre de gènes candidats identifiés pour la schizophrénie sont étudiés les effets de modulation potentiels sur le développement neurologique, comme par exemple pour le perturbé en schizophrénie -1 (DISC1) gène 13-15.
Le développement du cerveau est regulated par des facteurs génétiques et de leurs interactions avec l'environnement qui jouent un rôle dans, pré-périodes de développement péri-et post-natales. Un important facteur de risque génétique pour différents troubles du comportement sont les DISC1 16 gène. DISC1 fils knockdown à des défauts de migration chez la souris 13, 17, et la manipulation de l'expression de DISC1 dans le cortex en développement par l'IUE a été montré pour influer sur le comportement de souris adultes 18.
La manipulation de l'expression des gènes du cerveau par IUE présente plusieurs avantages par 19 rapport à la génération de lignées d'animaux transgéniques. Tout d'abord, l'expression des gènes dans des domaines d'intérêt est obtenue en quelques semaines à plusieurs mois plutôt que plusieurs générations d'élevage de rongeurs transgéniques lignes. Deuxièmement, des mécanismes de compensation au cours du développement précoce qui peut bouclier phénotypes chez les animaux de la lignée germinale ingénierie 20 sont évités. Troisièmement, en ciblant uniquement une population cellulaire spécifique ou une zone spécifique du cerveau, migratiou des différences de prolifération peuvent être directement comparés avec le non-mutant ou contrôlent côté controlatéral si électroporations unilatérales sont choisis. D'autre part, IUE n'a pas la précision de cre / lox moment induit-promoteur-driven d'expression et seulement une sous-population de cellules dans un certain domaine est ciblée qui conduit à une sorte de mosaïque de motif d'expression génique.
Pour de nombreuses applications expérimentales chez les rongeurs adultes, une transfection transitoire d'un nombre limité de cellules dans une région du cerveau peut être suffisante, voire souhaitée, de sorte que le principal avantage de la lignée germinale, les rongeurs transgéniques stables est négligeable. En fait, l'IUE est utile d'examiner si certaines cellules anormalement développés peuvent affecter tout un réseau de cellules ou de circuits. Un autre avantage pourrait être la capacité à démontrer des effets non de cellules-autonome d'un gène en raison de la nature de la mosaïque de la frappe. En outre, la génération de rats transgéniques et knock-out est encore à ses débuts et l'utilisationde l'IUE dans cette espèce pour l'étude des conséquences aberrantes de développement du cerveau est d'un grand intérêt.
Jusqu'à présent, un obstacle majeur à l'aide de l'IUE pour étudier les conséquences de l'intervention dans les animaux que les adultes, c'est le manque de succès de l'électroporation de surveillance. Jusqu'à présent, GFP-co-transfectée dans les neurones fluorescents rats nouveau-nés vivants ne pouvaient pas être détectés par fluorescence sous un microscope binoculaire convenable ou avec l'imagerie de fluorescence du spectre IVIS.
Pour surmonter cet obstacle, on co-transfecté un gène rapporteur de la luciférase et effectué bioluminescence imagerie en temps réel des chiots par trois dimensions (3D) la quantification de la zone du cerveau IUE.
A titre d'exemple pour démontrer l'applicabilité de ce procédé dans une analyse fonctionnelle ultérieure tester la manipulation génétique du développement neurologique, une co-injection de plasmides contenant DISC1 humain, la luciférase, et la GFP dans le ventricule latéral d'embryons de rat <sup> 3 suivie par électroporation avec une électrode de type brucelles a été effectuée. Bien que les signaux de fluorescence n'a été détectée dans les stades post-natales in vivo, d'un signal de bioluminescence solide dérivé de la luciférine par métabolisme gène de la luciférase a été co-transfecté détectée jusqu'à cinq semaines après la naissance. 3D-mesures de la zone du cerveau a permis de quantifier électroporation lequel chiots avec électroporation insuffisante ou égarés ont été identifiés dès le départ, donc, permettant l'affectation des animaux IUE (gène d'intérêt et brouillés contrôle) à des groupes expérimentaux avec appariés zones du cerveau électroporation de faible variabilité . L'utilisation de rats IUE adultes paradigmes comportementaux a été démontrée comme un exemple de l'utilité de ce protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre étude montre que IUE est adapté pour générer des rats adultes avec des neurones exprimant un transgène dans une zone désignée du cerveau et qui, à la suite de cette intervention, ces animaux présentent des changements de comportement indiquant la fonctionnalité de la manipulation effectuée. Dans cette étude, par exemple, le rat surexprimant DISC1 unilatéralement dans une petite partie du cortex préfrontal ont montré une hypersensibilité à l'amphétamine (figure 9).
Sélection des rats pour la réussite d'électroporation in vivo par imagerie par bioluminescence a été efficace dans le contrôle de la variabilité inhérente de la transfection de cellules IUE et a été appliquée pour générer des groupes avec une zone IUE homogène de faible variabilité inter-sujet pour les enquêtes ultérieures.
Dans cette étude, nous n'avons pas pu sélectionner chiots électroporation de la litière par détection de la fluorescence induite par GFP-co-électroporation chez l'animal nouveau-né, même quandugh en même temps et dans le même animal d'un signal de bioluminescence de la luciférase également co-électroporation n'a pu être détectée après l'injection luciférine (figure 6), et la GFP exprimant neurones étaient encore présents dans le cerveau à l'âge de six mois. Nous en concluons que, chez le rat, la réaction luciférase / luciférine est bien adapté pour différencier les animaux avec des cerveaux électroporées avec succès (Figure 3).
Le contrôle quantitatif de succès IUE se rapporte à la force du signal de bioluminescence qui est mesurée par les chiffres de photons à l'intérieur de la même durée d'exposition (figure 3) et correspond à l'activité enzymatique de la luciférase co-exprimés. Petits signaux de bioluminescence sont détectables par 100-200 chiffres de photons, et, à un rayonnement de ~ 1×10 4 photons / sec / cm 2 / spectacle stéradian 1000-2000 cellules GFP-taché à l'histologie dans le 6 mois cerveau de rat. Le disp signal le plus élevéétaient posées un éclat de jusqu'à ~ 5×10 6 photons / sec / cm 2 / stéradian et ~ 64 000 chefs d'accusation.
Dans la souche de rat Sprague Dawley utilisé, nous avons observé un affaiblissement du signal de bioluminescence longitudinalement avec l'âge et le signal a disparu au-delà de l'âge de P35 (Figure 4). À ce stade, nous ne savons pas si l'une ou l'autre transitoire, expression à base de vecteur plasmide de luciférase diminue, ou si le signal de bioluminescence affaiblit raison de l'augmentation massive du cerveau, ou les deux sont les causes pour le signal en voie de disparition. Pour le test fonctionnel présent dans les rats adultes, la sélection pour les études comportementales était simplement faite sur la base de l'emplacement du signal, mais pas par bioluminescence la force du signal.
Même si la surveillance de la bioluminescence quantitative 3D a permis la différenciation entre les différents domaines électroporation (figure 5), son exactitude a été limitée pour les cellules situées dans la dime de profondeurnsion du cerveau. figure 6 montre un exemple d'une électroporation de l'hippocampe où la mesure de la bioluminescence dans le 2D et le 3D image indique un bon positionnement de l'électroporation. Dans le cerveau post-mortem disséqué, un signal GFP-fluorescence a été détecté à environ la même position que le signal de bioluminescence, ce qui indique un ciblage correct de l'hippocampe. Mais histologie montre également que les cellules dans le cortex dorsal de l'hippocampe ont été la cible (Figure 7). Ceci indique que le test de bioluminescence est un outil utile pour détecter, chiots IUE positifs et aussi d'avoir une idée de la zone électroporation, mais, en fin de compte, l'imagerie ne peut pas remplacer l'autopsie histologie exactement localiser les cellules positivement ciblées.
Notre démonstration indique promesse pour l'application de la technologie IUE pour générer manipulations ciblées subtiles de régions corticales du cerveau ou de l'hippocampe pour simuler aberrances en cmigration ortical ou autres défauts qui peuvent influer sur le développement neurologique de l'animal adulte. Alors que l'électroporation bilatérale 26 a l'avantage d'un effet probable plus grande sur le comportement, il est aussi plus la mortalité des embryons. Électroporation unilatérale a été choisie afin de comparer les deux hémisphères avec un comme un contrôle interne, ainsi que pour montrer que même manipulation IUE dans un unilatérale, petite région est suffisante pour changer les comportements. Changements IUE-induits de la connectivité ou de l'architecture entre les neurones peuvent donc être induits sans évoquer une lésion et le match requise de la région-à-être IUE manipulé avec le test de comportement approprié dépend de la question scientifique.
Dépannage
Taille de la portée réduite Il existe plusieurs suggestions concernant l'augmentation de la survie des petits IUE. Tout d'abord, l'utilisation de très minces tubes capillaires en verre lors de l'électroporation de manière à minimiser Lesio tissulairen est recommandé. Deuxièmement, ne pas électroporer le premier embryon à la fin vaginale de chaque corne de l'utérus: mort du premier-né embryon augmente les chances d'un abandon de toutes les autres embryons. Troisièmement, après la naissance, les rats mères tuent souvent partie de leur progéniture à cause du stress périnatal. Afin de réduire le stress supplémentaire, ne pas commencer par l'imagerie en temps réel juste après la naissance, mais d'attendre sept jours.
Détection GFP-fluorescence des chiots
Une semaine après la naissance, aucun signal de fluorescence, soit en utilisant la fluorescence binoculaire en direct l'imagerie microscopique ou l'imagerie de fluorescence avec le SIIV spectre (les modes d'épifluorescence et transfluorescence; GFP excitation / émission: 465/520 nm et 500/540 nm). Il est possible que les deux, la transmission limitée de courte longueur d'onde d'excitation et d'émission de lumière à travers les tissus comme le crâne et le bruit de fond élevé d'autofluorescence de la peau prévenir en utilisant la fluorescence sous la described conditions chez le rat. Comme le montre la figure 6, le signal de la luciférase dans l'animal vivant peut également être détectée dans le cerveau disséqué (sans crâne) et là, également un signal de fluorescence est détectable (Figure 6D).
La différenciation de la bioluminescence dans les zones du cerveau étroitement espacés
Même dans l'illustration 3D de l'emplacement de la zone de bioluminescence ne peut être prédit à 100%. En particulier les cellules au-dessus ou au-dessous de la zone prévue peuvent également être ciblés accidentellement et transfectées. La position exacte doit être contrôlée par l'autopsie (fluorescence) histologie (voir Figure 7).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Tracy Young-Pearse et Atsushi Kamiya pour fournir des plasmides.
Ce travail a été financé par NEURON-ERA-NET DISCover à OU et CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) de CK, et (DE 792/2-4) MASS
Materials
| Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
| Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
| D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
| kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
| Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
| Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
| Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
| IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
| Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
| Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
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