局所トランスジェニックラットの発生により<em>子宮内</em>エレクトロポレーションおよび<em>インビボ</em>生物発光スクリーニング

国家と欧州の法律に基づいて、すべての動物実験は責任Landesministeriumエリーゼ漢方、環境世界ウントVerbraucherschutz（87-51.05.2010.A​​301 LANUV NRW）によって承認された。 1。 子宮内電気穿孔法この方法は、Walantus らによるラット3、ならびにRice ら。4についてJoveのに詳細に記載されており、ここでは簡単に要約されている。 6-8匹の産子数は、良好な転帰が得られます。 （下記参照）、全体的な生存率を増加させるために、少なくとも2つの非胚のエレクトロポレーションがあるべきである。 1.5μgの/μLを含むDNA-混合物を製造ターゲットプラスミド（shRNAを：をpENTR-U6、Invitrogen社、ユージーン、OR / DISC1の過剰発現：pCAX 21）、0.5μgの/プラスミド（pCAX）、0.5μgの/ GFPμLを含むルシフェラーゼμL 1X PBS溶液で染色ライトブルーにプラスミド（のpCAGGS 22）を含むファストグリーン色素でE。 ニードルピペットプラーとガラスキャピラリーの外に注射針を準備します。アルコール系消毒剤（講談Tinkturフォルテ）と高圧蒸気滅菌またはインキュベーションのいずれかにより手術器具を滅菌する。 16日受精（E16）の後に妊娠したラットに手術前にブプレノルフィンの術前の用量（0.05 mg / kg）を15分を管理します。その後、イソフルランチャンバー内に動物を麻酔。 麻酔時には、1.8％で0.4リットル/分であり、イソフルランで酸素の設定を使用して、麻酔装置に接続された呼吸マスク37℃温めておいた操作テーブル上の仰臥位でのラットを置く。 腹部を剃毛した後、講談社Tinkturフォルテ（アルコール系消毒剤）で剃毛面積を3回消毒する。 唯一の剃毛オペレーションフィールドを公開、無菌布でラットをカバーしています。 子宮内電気穿孔法で行う。 scissoで腹部を切る白線に沿ってR（〜2センチメートル）。 リングピンセットで慎重に子宮角を公開します。 全体手術中に温めた滅菌PBSで濡れた子宮壁を維持するように注意してください。 胚の側脳室のいずれかに薄いガラス針でDNA溶液を注入する。 胚の頭の周りに7ミリメートルの電極を配置します。上層皮質層の細胞集団をヒットするには、E16 23でIUEを実行し、わずかに背側/横傾向を注入心室上半球上の正極を配置。海馬細胞を標的とすることは、わずかに背側方向（ 図1）の横を注射された脳室とは反対側に正電極配置を変更してください。 方形波パルスエレクトロと950ミリ秒休憩で55 Vで5 50ミリ秒パルスでエレクトロポレーションを行う。 トンを増加させるために、各子宮角の膣の端部に第胚スペア彼のすべての胚の生存の可能性。 バック母ラットへの子宮角を置く。 吸収性ビクリル縫合糸材料と腹壁をスティッチ。 ビクリル縫合材料または縫合クリップで皮膚を閉じます。 バックホームケージに母ラットを置き、2〜3時間保温し。 動物施設の部屋や飼料を自由摂取でのホームケージに一人でラットを開催しています。彼らは、E22-24の間に出産する。 3週間の彼らの母と仔ラットを維持し、男女別、その後それらを分離。 2。酵素ルシフェラーゼ反応の生物発光ライブイメージングこの方法は、 子宮内でトランスフェクトされた細胞の位置を分析するために使用される。共同エレクトロポレーションホタルルシフェラーゼcDNAは、オキシルシフェリンのD-ルシフェリンを代謝すると、光子（ 図2を発するアクティブルシフェラーゼに翻訳されている</stron得>）。生じた発光は、出生後（ 図4）約35日齢までIVISスペクトラムの正エレクトロポレーションの若いラットの脳で検出することができる。 本研究では、ルシフェラーゼアッセイおよび生物発光イメージングは​​、P7から始まる行った。この時点は、母と仔が誕生ストレスから回復できるようにするために選ばれました。当初はP0に子犬を操作する場合は、仔の生存率は大幅​​に子犬が死亡して発見または母に食べたことの影響を受けました。 最初に、成功したエレクトロポレーションを有する仔ラットを、3分間の露光時間で2D-生物発光画像により識別される。続いて、正の仔はエレクトロポレーション領域の位置を特定するために、3D画像を作成するために使用される。 溶液15mgの/の濃度にPBS中でD-ルシフェリンナトリウム塩を希釈し、滅菌シリンジフィルターで濾過して滅菌する。 子犬の重さ。 上部の腹部に片手で子犬を取り、少し腹部を伸ばす。ルシフェリン溶液の腹腔内の体重の10μL/ Gを注入。古く、より機敏なものについては、ルシフェリンを注入する前に、誘導チャンバー内のイソフルランで子犬を事前に麻酔し。 3％のイソフルランでIVISスペクトル内XGI-8ガス麻酔システムのイソフルランの流入をオンにします。 麻酔システムのガラスノーズコーンに動物の鼻を入れてください。 それは深い麻酔（2〜3分）になるまで、腹臥位で動物を保​​持します。その後、1.5％イソフルラン流入を減らすことができます。 全体ごみから正の子犬を選択するために2D-生物発光測定を選択します。次の設定を使用 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 CHECを設定kmarkは8でメディアビニングとF /ストップと写真上、カメラは、測定を開始した後、上からの写真をとります。 励起フィルターセット：ブロック。 発光フィルタを設定します。開いた。 メディアにビニングを設定します。 1のF /停止を設定します。 設定ステージレベルAに 180秒に発光露光時間を設定します。 よりよいホタルルシフェラーゼの次DLIT設定を使用すると、正の子犬からエレクトロポレーションの領域を定量化するために3次元画像を作成するため。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 写真の上にチェックマークを設定し、カメラが測定を開始した後、上からの写真をとります。 構造上のチェックマークを設定して、動物の表面は、IVIS前生物発光測定によりスキャンされる。 Uそれ二週間の年齢まで、発光フィルタおよび露光時間の設定を、次発光フィルター1：590nmで、露出時間300秒発光フィルタ2：600nmの露光時間240秒発光フィルター3：620nmの露光時間180秒放射フィルタ4：640nmの露光時間120秒 P20より古いラット発光フィルター1：600nmで、露出時間300秒発光フィルタ2：620nmの露光時間300秒発光フィルター3：640nmの露光時間300秒 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 による高齢の動物における信号強度の減少に、露光時間は三大発光フィルタに拡大される。 設定段階レベルB メディアにビニングを設定します。 1のF /停止を設定測定後、月互いに区別するために耳孔コードによってラットをkとIVISイメージングライブ画像にそれらを一致させるそのケージに戻す前に、測定手順の最後に、イソフルラン流入をオフにして数分間温めプレートにラットを保つ。 3。生物発光画像の解析 3D画像、3D映画、信号源の体積の定量化の発生をリビングImageソフトウェアIVISスペクトルにプリインストールすることによって行われる。 3D画像の生成まず、表面形状を再構築する、そのため20から30パーセントの間の閾値を設定してください。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 EEN 6 "SRC =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> 波長ごとに10パーセントの画像閾値とDLIT 3D再構成を開始します。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 3Dツールバー内のアニメイトボタンを使用して3D映画を作成します。 3D画像の他の方向を選択するだけでなく、キーフレームなどのビューをズーム、 'レコード＆＃を押してください39、ボタン、別の位置/方向からの切り替えを記録。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。 4。行動実験行動試験は、ラットにおけるIUE媒介遺伝子操作は、成人期まで持続する長期的な効果を開始するかどうかを決定するために行った。存在する特定の場合、一過性の効果では、IUE後一方的な全長ヒトDISC1皮質過剰発現はドーパミン関連の具体的なテストとして、アンフェタミンの低用量とすることなく、（OF）オープンフィールドに移動をテストすることによって調べた行動24。丹羽らが行う。IUEマウスにおけるDISC1ノックダウン、IUEマウスではなく、コントロールを使用して、同様の手順で過敏症を示したアンフェタミン18。 子宮内で 、DISC1過剰発現ベクターを用いてエレクトロポレーションしたラットは、午後7時まで午前7時から12時間の明との実験室条件下で行われたと自由摂取を与えた。生後3ヶ月で、ラットは行動試験を受けた。 アンフェタミンの影響の読み出し、音と光隔離室に位置トゥルースキャン活性系のオープンフィールドとして移動を定量するために使用した。このシステムは、継続時間を測定し、オープンフィールドの余白やセンターで過ごした動物が移動し、時間と距離を距離だけでなく、行動25の飼育。 初日には、生理食塩水注射後の試験動物を秤量する。 腹腔内に生理食塩水（1×PBS）を1μl/ g体重を注入する。 右注射の後、オープンフィールドに動物を入れて、プロのシステムの測定を開始します。 15分ANのレコード3×5分間の部分にデータを細分dは。 背中そのホームケージに動物を置く。 二日目、アンフェタミン注射でのテスト動物を秤量する。 0.5 mg / mlのアンフェタミン溶液の腹腔内に1μlの/ g体重を注入する。 注射はオープンフィールドに動物を入れて、プロのシステムの測定を開始した直後。 15分間の記録と3×5分間の部分にデータを分割します。 そのホームケージに動物を返します。 運動を分析し、特定のトゥルースキャンソフトウェアによって生成挙動を飼育。グラフパッド（プリズム）でグラフを作成し、SPSS Statisticsのソフトウェアで統計を計算します。