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Neuroscience

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em> In utero</em> Eletroporação e<em> In vivo</em> Triagem Bioluminescência

Published: September 24, 2013
doi:
10.3791/50146
, , , ,
1Department of Neuropathology,Medical School Düsseldorf, 2Department of Molecular Genetics,Weizmann Institute for Science, 3Center of Behavioral Neuroscience,University of Düsseldorf

Summary

Genes podem ser manipulados durante o desenvolvimento do córtex ou do hipocampo do rato via in utero eletroporação (IUE) em E16, para permitir modificações rápidas e direcionadas na conectividade neuronal para estudos posteriores do comportamento ou neuropatologia em animais adultos. Pós-natal em imagem in vivo para o controle do sucesso IUE é realizada por bioluminescência de ativar luciferase cotransfectados.

Abstract

No útero electroporação (IUE) é uma técnica que permite a modificação genética das células do cérebro para investigar o desenvolvimento neuronal. Até agora, o uso de IUE para investigar o comportamento ou neuropatologia no cérebro adulto tem sido limitada por métodos insuficientes para o controlo do sucesso da transfecção IUE por técnicas não invasivas em animais após o nascimento.

Para o presente estudo, os ratos E16 foram utilizados para IUE. Após a injecção intraventricular de ácidos nucleicos para os embriões, o posicionamento dos eléctrodos de pinça é crítico para o direccionamento tanto do córtex ou do hipocampo em desenvolvimento.

Ventricular co-injecção e de electroporação de um gene de luciferase permitiu a monitorização das células transfectadas postnatally após injecção intraperitoneal luciferina no cão anestesiado P7 vivo por in vivo a bioluminescência, utilizando um dispositivo de IVIS Espectro com software de quantificação 3D.

<pclass = "jove_content"> definição de área de bioluminescência poderia diferenciar claramente entre electroporations corticais e do hipocampo e detectar um sinal longitudinalmente ao longo do tempo até 5 semanas após o nascimento. Esta técnica de imagem nos permitiu selecionar filhotes com um número suficiente de células transfectadas assumidos necessário para desencadear efeitos biológicos e, posteriormente, para realizar investigações comportamentais em três meses de idade. Como um exemplo, este estudo demonstra que IUE com o gene humano de comprimento completo Disc1 no córtex do rato levou à hipersensibilidade anfetamina. GFP cotransfectados pode ser detectado em neurônios por post mortem microscopia de fluorescência em criosecções indicando a expressão do gene presente em ≥ 6 meses após o nascimento.

Conclui-se que a imagem de bioluminescência pós-natal permite avaliar o sucesso de transfections transitórios com IUE em ratos. As investigações sobre a influência de manipulações genéticas tópicos durante neurodevelopment no cérebro adulto e sua conectividade está muito facilitada. Para muitas questões científicas, esta técnica pode complementar ou mesmo substituir o uso de ratos transgênicos e fornecer uma nova tecnologia para a neurociência comportamental.

Introduction

O desenvolvimento da eletroporação in utero método (IUE), que permite a modulação da expressão gênica no cérebro em desenvolvimento, tem sido um break-through, uma vez que permitiu estudar neurodesenvolvimento com relativa facilidade. 1-7 Alterações nos níveis de um gene alvo na expressão uma região específica do cérebro durante o desenvolvimento embrionário e / ou perinatal em roedores foram demonstrados criticamente influência proliferação neuronal, migração, arborização e conectividade. 8-10

A esquizofrenia é uma doença mental complexa, com sintomas agudos e crônicos que tem sido relacionados com anormalidades do desenvolvimento neurológico 11, 12 e, portanto, muitos dos genes candidatos identificados para a esquizofrenia são investigados os efeitos potenciais sobre a modulação do neurodesenvolvimento, como por exemplo para a interrompeu-in-esquizofrenia -1 (Disc1) gene 13-15.

O desenvolvimento do cérebro é regued por fatores genéticos e suas interações com o meio ambiente que desempenham papéis em, pré-períodos de desenvolvimento peri e pós-natal. Um importante factor de risco genético para várias desordens comportamentais é Disc1 os 16 genes. DISC1 knockdown leva a defeitos de migração em ratinhos 13, 17, e a manipulação de expressão Disc1 no córtex desenvolvimento por IUE foi mostrado para impactar o comportamento de ratinhos adultos 18.

Manipulando a expressão genética do cérebro por IUE tem várias vantagens em relação à geração 19 de linhagens de animais transgênicos. Em primeiro lugar, a expressão de genes dentro das áreas de interesse é alcançado dentro de semanas ou meses, em vez de várias gerações de criação de linhas de roedores transgênicos. Em segundo lugar, os mecanismos compensatórios durante o desenvolvimento precoce, que pode protegê fenótipos em animais de engenharia de 20 germinativas são evitados. Em terceiro lugar, apenas por meio de direccionamento numa população de células específico ou área específica do cérebro, migratiem ou diferenças de proliferação pode ser comparado diretamente com o não-mutante ou controlar lado contralateral se electroporations unilaterais são escolhidos. Por outro lado, IUE não tem a precisão de cre / lox-sincronismo induzido accionado o promotor de expressão e apenas uma sub-população de células de uma determinada zona é orientada conduzindo a uma espécie de mosaico da expressão genética padrão.

Para muitas aplicações experimentais em roedores adultos, a transfecção transiente de um número limitado de células, em uma região do cérebro, pode ser suficiente, ou mesmo desejado, de modo que a maior vantagem da estabilidade da linha germinativa, roedores transgénicos é negligenciável. Na verdade, IUE é útil para investigar se algumas células anormalmente desenvolvidos podem afectar toda uma rede de células ou circuitos. Outra vantagem pode ser a capacidade de demonstrar os efeitos das células-autônoma não de um gene, devido à natureza mosaico do hit. Além disso, a geração de ratos transgênicos e knockout ainda está em sua infância e do usode IUE nesta espécie para estudar as consequências do desenvolvimento do cérebro aberrantes é de alta de juros.

Até o momento, o maior obstáculo de usar IUE para investigar as conseqüências de intervenção nos animais como adultos é a falta de sucesso de monitoramento eletroporação. Até agora, a GFP co-transfectadas neurónios fluorescentes nas crias de ratos recém-nascidos vivos não podiam ser detectadas com um microscópio de fluorescência binocular adequado ou com a imagem de fluorescência do IVIS Spectrum.

Para superar este obstáculo, nós co-transfectadas de um gene repórter de luciferase e realizada bioluminescência imagens ao vivo de filhotes por três dimensões (3D) a quantificação da área do cérebro IUE.

Como um exemplo para demonstrar a aplicabilidade deste método num ensaio funcional depois testando a manipulação genética do neurodesenvolvimento, uma co-injecção de plasmídeos contendo Disc1 humano, luciferase e GFP no ventrículo lateral de embriões de rato <sup> 3 seguido por electroporação com um eléctrodo de pinça foi realizada. Embora os sinais de fluorescência não pôde ser detectado na fase pós-natal in vivo, um sinal de bioluminescência sólido derivado do metabolismo luciferina pelo gene da luciferase de co-transfectado foi detectado até cinco semanas após o nascimento. 3D-medidas da área do cérebro quantificação permitiu electroporados pelo qual foram identificados filhotes com eletroporação insuficiente ou equivocada desde o início, assim, permitindo a atribuição de animais IUE (gene de interesse e mexidos controle) para os grupos experimentais com áreas cerebrais eletroporados combinados de baixa variabilidade . A utilização de ratos adultos em IUE paradigmas comportamentais foi demonstrada como um exemplo da utilidade deste protocolo.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram autorizados pela Landesministerium responsável für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301), de acordo com a legislação nacional e europeia. 1. In utero Eletroporação Este método foi descrito pormenorizadamente na JOVE para o rato por Walantus et al. 3, bem como Rice et al. 4 e é aqui resumida brevemente. Um tamanho de ninhada de 6-8 filhotes rende um bom resultado. Deve haver, pelo menos, dois embriões não electroporadas, a fim de aumentar a taxa de sobrevivência global (ver abaixo). Preparar DNA-mistura que contém 1,5 mg / mL de meta-Plasmid (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, Eugene, OR / Disc1 superexpressão: pCAX 21), 0,5 mg / mL de luciferase contendo plasmídeo (pCAX), 0,5 ug / uL GFP contendo plasmídeo (pCAGGS 22) em 1x PBS solução manchado blu luze com Fast Green Dye. Prepare agulhas de injeção de capilares de vidro com uma agulha Pipeta Extrator. E esterilizar instrumentos cirúrgicos ou em autoclave ou a incubação com um desinfetante à base de álcool (kodan Tinktur forte). Administrar uma dose pré-operatória de buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 minutos antes da cirurgia para uma rata grávida 16 dias após a fertilização (E16). Então anestesiar os animais numa câmara de isoflurano. Após a anestesia, coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma mesa de operação 37 ° C-aquecido com máscara de respiração ligado ao aparelho de anestesia, usando configuração de oxigênio em 0,4 L / min e isoflurano em 1,8%. Depois de raspar o abdômen, desinfetar a área depilada três vezes com kodan Tinktur Forte (um desinfetante à base de álcool). Cubra o rato com panos estéreis, expondo apenas o campo de operação raspada. Execute in utero eletroporação. Corte o abdômen com uma Tesourasr ao longo da linha alba (~ 2cm). Expor os cornos uterinos cuidadosamente com um anel de fórceps. Tome cuidado para manter a parede do útero molhado com aquecido PBS estéril durante toda a cirurgia. Injectar solução de ADN com uma agulha de vidro fino para um dos ventrículos laterais de embriões. Coloque o eletrodo 7 milímetros ao redor da cabeça do embrião. Para bater uma população de células de camadas corticais superiores, realizar a IUE em E16 23 e posicionar o eletrodo positivo no hemisfério acima do ventrículo injetado com uma ligeira dorsal / lateral, tendência. Para atingir as células do hipocampo de alterar a colocação do eléctrodo positivo para o lado oposto do que o ventrículo lateral, injectados com a direcção ligeiramente dorsal (Figura 1). Realize eletroporação por cinco a 50 pulsos ms a 55 V com 950 breaks ms com uma onda de pulso electroporador quadrado. Poupar o primeiro embrião no final vaginal de cada trompa do útero, a fim de aumentar a tele as chances de sobrevivência de todos os embriões. Coloque os chifres do útero de volta para o rato mãe. Stich da parede abdominal com uma Vicryl material absorvível sutura cirúrgica. Fechar a pele com o material de sutura de Vicryl ou com grampos de sutura. Coloque o rato mãe de volta para a gaiola e mantê-lo quente por 2-3 horas. Segure os ratos sozinho em sua gaiola na sala de instalações para animais e ração à vontade. Eles dão à luz entre E22-24. Manter os filhotes de ratos com sua mãe por três semanas e depois separá-los por gênero. 2. Bioluminescência Imagens ao vivo da reação enzimática da luciferase Este método é utilizado para analisar a posição das células transfectadas no útero. Co-electroporados cDNA firefly luciferase é traduzido em luciferase ativo, que após metabolização de D-luciferina para oxiluciferina, emite um fóton (Figura 2 </strong>). A luminescência resultante pode ser detectado no cérebro de ratos jovens positivos electroporadas em um espectro IVIS-se com a idade de cerca de 35 dias após o parto (Figura 4). No presente estudo, o ensaio de luciferase e a bioluminescência de imagem foi realizado a partir de P7. Este ponto de tempo foi escolhido para permitir que a mãe e os filhotes para recuperar do stress do nascimento. Quando inicialmente trabalhando com os filhotes no P0, a sobrevivência das crias foi severamente afetado em que os filhotes foram encontrados mortos ou comido pela mãe. Inicialmente, os filhotes de rato com a electroporação de sucesso são identificados por uma imagem 2D-bioluminescência com um tempo de exposição de três minutos. Posteriormente, os filhotes positivos são utilizados para a criação de imagens 3D, a fim de especificar a localização da área electroporados. Dilui-se o sal de sódio D-luciferina em PBS a uma concentração de 15 mg / ml e esterilizar por filtração através de um filtro de seringa estéril. Pesar os filhotes. Leve o filhote em um lado com o abdômen em cima e esticar o abdômen ligeiramente. Injectar 10 mL / g de peso corporal de solução de luciferina intraperitoneal. Para os mais velhos e mais ágeis, pré-anestesiar os filhotes com isoflurano na câmara de indução antes de injetar a luciferina. Ligue o influxo isoflurano da XGI-8 Gas Anestesia Sistema dentro do IVIS Spectrum com 3% de isoflurano. Coloque o focinho do animal para os cones do nariz de vidro do sistema de anestesia. Mantenha o animal em uma posição propensa até que esteja em anestesia profunda (2-3 min). Em seguida, reduzir o influxo de isoflurano a 1,5%. Escolha uma medição 2D-bioluminescência para selecionar filhotes positivos de toda a ninhada. Use as seguintes configurações Clique aqui para ver maior figura . Defina um checkmark na fotografia com binning médio e F / Stop em 8, a câmera tira uma foto de cima após o início da medição. Definir filtro de excitação: block. Definir filtro de Emissão: aberto. Definir Binning para médio. Defina F / Stop em 1. Definir o nível de Estágio A. Definir luminescência tempo de exposição a 180 seg. Para a criação de imagens 3D, a fim de melhor quantificar a área electroporados dos filhotes positivos, use as seguintes configurações DLIT para luciferase de vaga-lume. Clique aqui para ver maior figura . Definir uma marca de seleção na fotografia, a câmera tira uma foto de cima após o início da medição. Definir uma marca de verificação na estrutura, a superfície do animal é digitalizado pela IVIS antes da medição da bioluminescência. Use após filtros de emissão e configurações de tempo de exposição até a idade de duas semanas; Filtro de emissão de 1: 590 nm, tempo de exposição de 300 seg Filtro de emissão 2: 600 nm, tempo de exposição de 240 seg Filtro de emissão 3: 620 nm, tempo de exposição de 180 seg Filtro de emissão de 4: 640 nm, tempo de exposição de 120 seg Para os ratos com mais de P20 Filtro de emissão de 1: 600 nm, tempo de exposição de 300 seg Filtro de emissão 2: 620 nm, tempo de exposição de 300 seg Filtro de emissão 3: 640 nm, tempo de exposição de 300 seg Clique aqui para ver maior figura . Devido à diminuição da intensidade do sinal em animais velhos, o tempo de exposição é ampliada para os três melhores filtros de emissão. Definir o nível de Estágio B Definir Binning para médio. Defina F / Stop em 1 Após a medição, mar k os ratos por um código Earhole para diferenciá-los uns dos outros e combiná-los com as fotos de imagem IVIS Vivo No final do procedimento de medição, desligar isoflurano afluxo e manter o rato sobre a placa aquecida durante alguns minutos, antes de voltar para a sua jaula. 3. Análise de Imagens bioluminescência A geração de imagens em 3D, os filmes em 3D e a quantificação do volume da fonte de sinal é feita pelo software de estar imagem pré-instalado no IVIS Spectrum. Geração de imagens em 3D Primeiro, reconstruir a topografia da superfície, portanto, definir o limite entre 20-30%. Clique aqui para ver maior figura . een 6 "src =" / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg "/> Comece DLIT reconstrução 3D com um limite de imagem de 10% para cada comprimento de onda. Clique aqui para ver maior figura . Clique aqui para ver maior figura . Clique aqui para ver maior figura . Crie filmes em 3D usando o botão animado dentro da barra de ferramentas 3D. Escolha diferentes orientações da imagem em 3D, bem como visualizações de zoom como quadros-chave e pressione o 'Record & #39; botão, registrando a passagem de uma posição / orientação para o outro. Clique aqui para ver maior figura . 4. Teste Comportamental Teste comportamental foi realizado a fim de determinar se as manipulações do gene IUE mediadas no rato pode iniciar efeitos de longo prazo que persistem na idade adulta. No presente caso, o efeito do transiente, unilateral comprimento total DISC1 humano cortical superexpressão após IUE foi investigada por meio de testes de locomoção em um campo aberto (OF), com e sem uma dose baixa de anfetamina, como um teste específico para dopamina relacionada comportamento 24. Num procedimento semelhante realizada por Niwa et al. Em ratinhos IUE usando knockdown Disc1, ratinhos IUE mas não controlos mostraram hipersensibilidadea anfetamina 18. Os ratos que foram no útero electroporated com um overexpressing vetor DISC1 foram realizados em condições de laboratório, com luz 12 horas sete horas – sete horas e foram alimentados ad libitum. Aos 3 meses de idade, os ratos foram submetidos a testes de comportamento. Para quantificar a locomoção como uma leitura dos efeitos da anfetamina, um campo aberto de um sistema de atividade Tru digitalização situado em uma câmara de som e de luz isolado foi usado. Este sistema mede o tempo de duração e distância os movimentos de animais, tempo e distância passados ​​na margem ou no centro do campo aberto, bem como a criação de comportamento 25. No primeiro dia, depois de testar a injecção de soro fisiológico Pesar os animais. Injectar por via intraperitoneal 1 ul / g de peso corporal de uma solução salina (PBS 1x). Logo após a injeção, colocar o animal para o campo aberto e iniciar a medição do sistema TruScan. Record para 15 min umad subdividir dados em 3 x 5 min partes. Coloque o animal de volta para sua gaiola. Segundo dia, teste na injeção de anfetamina Pesar os animais. Injectar por via intraperitoneal 1 ul / g de peso corporal de uma solução a anfetamina 0,5 mg / ml. Logo após a injeção de colocar o animal para o campo aberto e iniciar a medição do sistema TruScan. Recorde durante 15 min e subdividir dados em 3 x 5 min partes. Devolver o animal para sua gaiola. Analisar locomoção e criação de comportamento gerado pelo software de digitalização Tru específico. Crie gráficos com GraphPad (Prisma) e calcular estatísticas pelo software SPSS Statistics.

Representative Results

A Figura 3 mostra viver medições de imagem de três filhotes de ratos em P7 após a injeção de 150 mg luciferina / kg de peso corporal. As diferenças de intensidade do sinal, indicando a variabilidade na eficiência da IUE são visíveis. Bioluminescência sinais fortes foram registados até P36 (Figura 4). Na Figura 5, a capacidade de definir cortical (Figuras 5A e 5C) e hipocampo (Figuras 5B e 5D), eletroporação de imagem de bioluminescência estão representados. A correlação entre o sinal de bioluminescência (Figura 7A), com o seu sinal de fluorescência após a remoção do crânio (Figura 7B) e as células electroporadas-GFP correspondentes no cérebro cryosectioned (Figura 8) ao P14 estão ilustrados nas Figuras 6-8. De nota, não houve detecção de um sinal de fluorescência em ratos vivos em qualquer ponto de tempo. tenda "> in vivo bioluminescência imagiologia permite discriminação aproximado de diferentes áreas do cérebro electroporadas por 2D (Figuras 5A e 5B), que é melhorada com o programa de software DLIT IVIS Espectro de gerar imagens 3D (Figuras 5C e 5D). Nos exemplos mostrados , electroporação do córtex pré-frontal e hipocampo podem ser distinguidos. Deve notar-se que, enquanto que aponta para electroporar o hipocampo, algumas células progenitoras para o córtex deitada dorsal do hipocampo pode também ser atingido (Figura 7). Rats unilateralmente no útero eletroporados com pCAX vetor para o córtex e, posteriormente, com superexpressão completo DISC1 humano comprimento foram investigados tanto espontânea e hiperatividade induzida por anfetamina como adultos. Rats eletroporados com pCAX-DISC1 foram hipersensíveis a uma dose baixa de anfetamina. Estes ratos movido significativamente more após o tratamento do que as anfetaminas após a injecção de soro fisiológico, enquanto os animais de controlo não o fez (Figura 10). Figura 1. Esquema da posição do eletrodo para A) eletroporação e B córtex) eletroporação hipocampo; verde = DNA injetado-Mix dentro do ventrículo. Figura 2. Reacção da luciferase. Figura 3. A medição de luminescência do P7 ratos após injecção de 150 mg / kg de peso corporal luciferina; tempo de exposição de 180 seg; A) ratos com nenhum sinal de luminescência, B) de rato com um sinal de bioluminescência fraca, C rato) com um sinal de luminescência forte. Figura 4. A linha do tempo da medição de bioluminescência consecutivas do mesmo rato após injecção de 150 mg / kg de luciferina demonstrando uma grande janela de tempo em que o sucesso IUE pode ser detectada. . Figura 5 Ilustração de diferenças entre eletroporação cortical e hipocampal no P7 A) e B) as imagens 2D;. C) e D) as imagens em 3D; A) e C) do córtex; B) e D) do hipocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg "> Clique aqui para ver maior figura. Figura 6. Ilustração de E16 eletroporação do hipocampo de um filhote de rato em P14 A) 2D imagem de bioluminescência B) ilustração 3D da bioluminescência sinal C) dissecado cérebro com sinal de bioluminescência D) cérebro com GFP sinal epi-fluorescência. Clique aqui para ver maior figura . Figura 7. Detalhe de uma imagem de fluorescência de uma seção crio 20 mM do mesmo P14 cérebro de rato electroporados com GFP contendo plasmídeo e luciferasevetor, coloração núcleos com DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro denteado; FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Animação em 3D de um hipocampo electroporados rato em P14. Figura 8. Esquema de ensaio anfetamina: a injeção de solução salina primeiro dia, antes de 15 min o julgamento, 24 horas mais tarde anfetamina injeção antes do teste na câmara de campo aberto. Figura 9. Teste de anfetamina. Gráfico de barras mostrando distância percorrida (em cm) do animal gravado por um sistema TrueScan mais de 15 min barras brancas = grupo controle;. Barras cinza = grupo superexpressão DISC1; grupo controle n = 10; DISC1 grupo superexpressão n = 11; ANOVA: geno * Tratamento p = 0,043; T-Test para salina tempo total vs ns = não significativo anfetaminas Pcontrol = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Discussion

O nosso estudo mostra que IUE é adequado para gerar ratos adultos com os neurónios que expressam um transgene em uma área selectivo do cérebro e que, como resultado desta intervenção, estes animais apresentam mudanças de comportamento, indicando a funcionalidade da manipulação realizada. Neste estudo, por exemplo, os ratos que sobrexpressam Disc1 unilateralmente em uma pequena parte do córtex pré-frontal mostraram hipersensibilidade direcção anfetamina (Figura 9).

Seleção de ratos para o sucesso eletroporação in vivo por bioluminescência imagem foi eficiente no controle da variabilidade inerente de transfecção de células IUE e foi aplicado para gerar grupos com uma área homogênea IUE de baixa variabilidade inter-sujeitos para investigações posteriores.

Neste estudo, não fomos capazes de selecionar filhotes electroporados da ninhada por detecção de fluorescência induzida por GFP co-electroporados no animal recém-nascido, mesmo thourg, ao mesmo tempo e no mesmo animal um sinal de bioluminescência da luciferase igualmente co-electroporado poderia ser detectado após a injecção de luciferina (Figura 6), e o GFP expressando neurónios estavam ainda presentes no cérebro com uma idade de seis meses. Conclui-se que, no rato, a reacção da luciferase / luciferina é bem adequada para diferenciar animais com cérebros electroporadas sucesso (Figura 3).

O controlo quantitativo de sucesso IUE relaciona-se com a intensidade do sinal de bioluminescência que é medida pela contagem de fotões dentro do mesmo tempo de exposição (Figura 3) e corresponde à actividade enzimática de luciferase co-expressa. Sinais de bioluminescência pequenas são detectáveis ​​por 100-200 contagens de fótons, e, em um esplendor de ~ 1×10 4 fótons / seg / cm 2 / show esterradiano 1.000-2.000 as células marcadas com GFP na histologia no 6 meses de idade cérebro de rato. A maior disp sinalDefiniu um brilho de até ~ 5×10 6 fótons / seg / cm 2 / esterradiano e ~ 64.000 contagens.

Na estirpe de ratos Sprague Dawley utilizado, observou-se um enfraquecimento do sinal de bioluminescência longitudinalmente com o aumento da idade e do sinal desapareceu para além da idade de P35 (Figura 4). Neste momento, nós não sabemos se quer o transitório, expressão baseada em vetor plasmídeo de luciferase diminui, ou se o sinal de bioluminescência enfraquece devido ao aumento da massa cerebral, ou ambas são as causas para o sinal desaparecer. Para o presente ensaio funcional em ratos adultos, a selecção para os estudos de comportamento foi feita apenas com base na localização do sinal, mas não pela intensidade do sinal da bioluminescência.

Apesar de a monitorização da bioluminescência quantitativa 3D permitiram a diferenciação entre as diferentes áreas de electroporação (Figura 5), o seu rigor foi limitada para as células localizadas na profundidade dimension do cérebro. Figura 6 mostra um exemplo de uma electroporação do hipocampo onde a medição da bioluminescência no 2D e a imagem 3D indicado um bom posicionamento da electroporação. No cérebro post mortem dissecados, um sinal de GFP foi detectado por fluorescência mais ou menos na mesma posição que o sinal de bioluminescência, indicando correcto direccionamento do hipocampo. Mas mostra histologia que também as células do córtex dorsal do hipocampo foram alvo (Figura 7). Isso indica que o ensaio de bioluminescência é uma ferramenta útil para detectar, filhotes IUE positivos e também para ter uma idéia da área electroporados, mas, em última instância, a imagem não pode substituir histologia post mortem a exatamente localizar células-alvo de forma positiva.

Nossa demonstração indica promessa para a aplicação da tecnologia de IUE para gerar manipulações sutis alvo de regiões cerebrais corticais ou do hipocampo para simular aberrações em cmigração ortical ou outros defeitos do desenvolvimento neurológico que podem influenciar o animal adulto. Enquanto electroporação bilateral 26 tem a vantagem de um possível efeito maior sobre o comportamento, há também mais a mortalidade dos embriões. Eletroporação unilateral foi escolhido a fim de comparar os dois hemisférios com um como um controle interno, bem como para mostrar que, mesmo manipulando IUE em um unilateral, pequena região é suficiente para mudar o comportamento. Mudanças induzidas pelo IUE na conectividade entre os neurônios ou arquitetura pode, assim, ser induzido sem evocar uma lesão eo jogo necessário da região para-ser-IUE-manipulado com o teste comportamental apropriada depende da questão científica.

Resolução de problemas

Tamanho da ninhada reduzida Há várias sugestões sobre o aumento da sobrevivência dos filhotes IUE. Em primeiro lugar, a utilização de capilares de vidro muito finas durante a electroporação, a fim de minimizar o tecido Lesion é recomendada. Em segundo lugar, não electroporate o primeiro embrião no final vaginal de cada trompa do útero: a morte do primogênito embrião aumenta as chances de um aborto de todos os outros embriões. Em terceiro lugar, após o nascimento, ratas mães muitas vezes matar parte de sua descendência devido ao estresse perinatal. A fim de reduzir o estresse adicional, não comece com a imagem ao vivo logo após o nascimento, mas esperar por sete dias.

Detecção de fluorescência da GFP-dos filhotes

Em uma semana após o nascimento, nenhum sinal de fluorescência ou usando fluorescência binocular ao vivo imagens microscópicas ou imagens de fluorescência com o IVIS Spectrum (modos de epifluorescência e transfluorescence, pois GFP excitação / emissão: 465/520 nm e 500/540 nm). É possível que ambos, a transmissão limitada de curto comprimento de onda de excitação e emissão de luz através do tecido como o crânio e o fundo alto autofluorescência da pele prevenir utilizando fluorescência sob a desccondições ribed no rato. Como mostrado na Figura 6, o sinal de luciferase no animal vivo também pode ser detectada no cérebro dissecado (sem crânio) e há, também um sinal de fluorescência é detectável (Figura 6D).

Diferenciação de bioluminescência em áreas do cérebro espaçados

Mesmo na figura 3D a localização da área de bioluminescência não pode ser previsto a 100%. Especialmente as células sobre ou abaixo da área prevista também pode ser acidentalmente direccionada e transfectadas. A posição exacta tem de ser controlado por post-mortem (fluorescência) histologia (ver Figura 7).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem Tracy Young-Pearse e Atsushi Kamiya para a prestação de plasmídeos.

Este trabalho foi financiado pela Neuron-ERANET Discover para OU e CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CK, e (DE 792/2-4) para MASS

Materials

Reagent name
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Invitrogen 14190-250 without calcium, without magnesium
D-luciferin, sodium salt SynChem OHG, Germany BC218 CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase
Fast Green FCF Sigma Aldrich, USA F7258-25G CAS: 2353-45-9
D-Amphetamine Sigma Aldrich, USA A 5880 CAS: 51-63-8
kodan Tinktur forte Schülke & Mayr GmbH, Germany 104 005
Material / product
Glass capillaries Sutter Instrument Novato, California, USA borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm
Needle Pipette Puller David Kopf Instruments Tujunga, California, USA
Tweezer electrode Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7)
Surgical Scissors – sharp Fine Science Tools Heidelberg, Germany Straight, 12 cm (14002-12)
Ring Forceps Fine Science Tools Heidelberg, Germany 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) Nepa Gene CO., LTD. Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan (CUY21SC)
Vicryl surgical suture material Ethicon Norderstedt, Germany 3-0; 2 Ph. Eur;
Wound Clip Applicator Fine Science Tools Heidelberg, Germany Reflex 9 mm (12032-09)
Syringe filter VWR Darmstadt, Germany 0.45 μm cellulose acetate
IVIS Spectrum Caliper Life Science / PerkinElmer Waltham, MassachusettsUSA
XGI-8 Gas Anesthesia System PerkinElmer Waltham, Massachuset tsUSA
Open-field Coulbourn Instruments Allentown, USA (40 x 40 x 39 cm)
Tru Scan activity system Coulbourn Instruments Allentown, USA
Table of recipes
Number Buffer name Content Comments
1 DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing 1.5 μg/μl pCAX humanDISC-1,
0.5 μg/μl pCAX-luciferase,
10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O		 100 μl of the mixture are enough for ~5 IUE
2 DNA-Mixure for control 0,75 μg/μl control shRNA1, 0,75 μg/μl control shRNA2, 0.5 μg/μl pCAX-luciferase, 0.5 μg/μl pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O 100 μl of the mixure are enough for ~5 IUE
3 Fast green Dye 10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O
4 D-luciferin solution 15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS
5 Amphetamine solution 0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS

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Vomund, S., Sapir, T., Reiner, O., de Souza Silva, M. A., Korth, C. Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening. J. Vis. Exp. (79), e50146, doi:10.3791/50146 (2013).
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