4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas
Summary
La viabilidad celular depende de una gestión oportuna y eficiente de mal plegamiento de proteínas. Aquí se describe un método para visualizar los diferentes destinos posibles de una proteína mal plegada: replegamiento, la degradación, o el secuestro de inclusiones. Se demuestra el uso de un sensor de plegado, Ubc9<sup> Ts</sup>, Por proteostasis seguimiento y control de calidad en la agregación de células vivas mediante microscopía 4D.
Abstract
Una de las tareas fundamentales de toda célula viva es mantener el correcto plegamiento de las proteínas recién sintetizadas frente a las siempre cambiantes condiciones ambientales y un ambiente intracelular que está estrechamente empaquetados, pegajosa y peligrosas para la estabilidad de la proteína 1. La capacidad de balancear dinámicamente la producción de proteínas, plegamiento y la degradación demanda altamente especializada maquinaria de control de calidad, cuya absoluta necesidad se observa mejor cuando funciona mal. Las enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica, Alzheimer, Parkinson, y ciertas formas de fibrosis quística tienen un vínculo directo con plegamiento de proteínas componentes de control de calidad 2, y por lo tanto el desarrollo terapéutico futuro requiere un conocimiento básico de los procesos subyacentes. Nuestro desafío experimental es entender cómo las células integrar señales de daños y organizar respuestas que se adaptan a diversas circunstancias.
La razón principal por la cual mal plegamiento de proteínas representa un thre existencialen que la célula es la propensión de las proteínas incorrectamente plegadas a agregarse, lo que provoca una perturbación global de la gente y delicado ambiente intracelular plegable 1. La salud de plegado, o "proteostasis", del proteoma celular se mantiene, incluso bajo la presión del envejecimiento, el estrés y el daño oxidativo, mediante la acción coordinada de las diferentes unidades mecánicas en un sistema de control de calidad elaborada 3,4. Una maquinaria especializada de las chaperonas moleculares puede unir no nativos polipéptidos y promover su plegamiento en el estado nativo 1, a orientar para la degradación por el sistema de la ubiquitina-proteasoma 5, o directamente a inclusiones de agregación de protección 6-9.
En eucariotas, la calidad citosólica agregación de control de carga se reparte entre dos compartimientos 8-10: El compartimiento de control de calidad juxtanuclear (JUNQ) y el depósito de proteína insoluble (IPOD) (Figura 1 – Modelo).Las proteínas que están ubiquitinadas por la proteína de la maquinaria de plegamiento de control de calidad se entregan a la JUNQ, donde son procesados para su degradación por el proteasoma. Proteínas mal plegadas que no se ubiquitinadas se desvían a la IPOD, donde se agregan activamente en un compartimiento protector.
Hasta este punto, el paradigma metodológico de células vivas microscopia de fluorescencia ha sido en gran medida a las proteínas de la etiqueta y el seguimiento de su ubicación en la celda específica en los puntos de tiempo y por lo general en dos dimensiones. Como las nuevas tecnologías han empezado a conceder experimentadores acceso sin precedentes a la escala submicrónica en las células vivas, la arquitectura dinámica del citosol ha llegado a la vista como una frontera desafiante nuevo para la caracterización experimental. Se presenta un método para el rápido seguimiento de las distribuciones espaciales en 3D de múltiples proteínas marcadas fluorescentemente en el citosol de levadura con el tiempo. Timelapse 3D (4D imagen) no es sólo un desafío técnico, rataella, sino que también facilita un cambio dramático en el marco conceptual utilizado para analizar la estructura celular.
Utilizamos una proteína citosólica sensor plegable en levaduras vivas para visualizar los destinos distintos de las proteínas mal plegadas en el control de calidad de la agregación celular, utilizando una rápida visualización en 4D fluorescente. El mutante sensible a la temperatura de la proteína Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) es extremadamente eficaz tanto como un sensor de proteostasis celular, y un modelo fisiológico para el control de seguimiento de la calidad de agregación. Al igual que con la mayoría de las proteínas ts, ts Ubc9 es totalmente plegada y funcional a temperaturas permisivas por activos chaperonas celulares. Por encima de 30 ° C, o cuando la célula se enfrenta a estrés misfolding, Ubc9 misfolds ts y sigue el destino de una proteína globular nativa que ha sido plegadas incorrectamente debido a la mutación, la desnaturalización por calor, o el daño oxidativo. Por fusión a GFP o otros fluoróforos, que pueden ser rastreados en 3D como forma estrés Foci, o es dicorregida a JUNQ o IPOD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestras intuiciones sobre los procesos bioquímicos se derivan de experimentos de mesa de laboratorio en los que se permite una solución bien mezclada de los reactivos y productos para alcanzar el equilibrio en un vaso de precipitados. En tal entorno, la concentración de una especie química dada se puede expresar como un número único, que es la relación de la cantidad molar de las moléculas a un volumen macroscópico. Mucho de lo que sabemos acerca de la estructura y función de proteínas se deriva del uso de métodos que reflejan la imagen clásica, la reacción a granel: transferencias Western, centrifugaciones y mediciones espectrofotométricas realizadas en los extractos de los homogeneizados de toda la población de células.
A medida que la tecnología que utilizamos para observar las células bajo magnificación aumenta a pasos agigantados, se hace cada vez más claro que las condiciones en las que las reacciones bioquímicas tienen lugar más en vivo soportar sólo el más mínimo parecido con las del escenario de sobremesa clásico. No sólo es el interior de la celLa densa medio ambiente, en el que los efectos apiñamiento sustancialmente alterar las actividades de diversos reactivos, también es todo lo contrario de bien mezclada. Esto explica la disparidad frecuente entre in vitro e in vivo de la eficiencia en una amplia gama de reacciones macromoleculares complejas.
En ninguna parte son intuiciones que surgen desde lo clásico en experimentos in vitro bioquímicos más propensos a engañar como en las cuestiones relacionadas con el plegado en vivo, mal plegamiento y la agregación de las proteínas. Considerando que los estudios de química de proteínas en las reacciones a granel puede tratar el problema de plegado para una proteína dada como un simple sí o no cuestión, cualquier intento de rastrear la dinámica de poblaciones enteras de macromoléculas en una célula viva debe ser sensible a la distribución total de posible resultados conformacionales disponibles para una cadena polipeptídica, y en particular con el riesgo de mal plegamiento y la agregación. Por ejemplo, podríamos examinar una célula Ly mayorEstado de agregación de una proteína por Western Blot, y determinar que la proteína es principalmente insoluble y no ubiquitinated. Sin embargo, en la célula viva una discreta sub-población de la proteína, difíciles de detectar cuando un promedio sobre muchas células, puede ser soluble y ubiquitinated en un compartimiento particular, cuando la concentración local de la especie es extremadamente alta. El último escenario puede tener consecuencias más importantes para la viabilidad de la célula que el bulto de mayor tamaño sub-población. Además, mientras que chaperones mostrar una variedad de comportamientos pleiotrópicos y funciones in vitro, se está haciendo evidente que en la célula de sus funciones discretas están espacial y temporalmente limitado.
En el paradigma emergente para la comprensión de la bioquímica, la concentración se convierte en una propiedad variable de cada específico nano-medio ambiente en la célula, y los eventos moleculares que subyacen a los procesos biológicos deben analizarse no sólo en el tiempo, sino también en space. El enfoque de las imágenes de 4D que aquí se presenta permite el modelado sensible de mal plegamiento de proteínas en células vivas, aunque puede ser utilizada para estudiar cualquier número de otros procesos biológicos y cómo se regulan en el espacio, el tiempo, y como consecuencia de variaciones en las condiciones ambientales. En este trabajo se utiliza el sensor Ubc9 ts plegado, lo que efectivamente demuestra las etapas y las opciones para hacer frente a la aparición de la agregación de proteínas en el citosol. Además de ilustrar la biología celular de control de calidad de agregación, este enfoque puede servir como una herramienta poderosa para descifrar el efecto de las perturbaciones específicas o mutaciones genéticas en proteostasis (por ejemplo Ubc9 ts se puede utilizar para medir la tensión de plegado de proteínas en respuesta a la oxidación, la expresión de un agregado tóxico, o mutaciones en la vía de control de calidad).
4D formación de imágenes es también esencial para determinar con precisión la localización de proteínas o colocalización entre dos proteínas diferentess, y para la detección de fenómenos que tal vez ser transitorios, pero importante. Por ejemplo, especialmente en un organismo esférico pequeño tal como una levadura, puede parecer ser el caso de que una estructura o agregado tiene localización yuxtanuclear, mientras que las imágenes de 4D puede revelar que este es simplemente un artefacto del ángulo de inspección.
En el experimento de ejemplo que presentamos aquí, se demuestra el uso de un modelo misfolded proteínas, Ubc9 ts, de seguir el control de agregación de calidad en el tiempo y el espacio en el citosol. A la temperatura permisiva, Ubc9 ts se dobla y se difunde en el núcleo y el citosol. Al calor inducido por mal plegamiento, inicialmente se forma rápidamente difunden pequeños focos de tensión agregados que son procesados por la degradación proteasomal. Cuando el proteasoma se inhibe parcialmente, estos focos de tensión se convierte en JUNQ y inclusiones iPOD en el transcurso de aproximadamente 2 horas. Si la degradación mediada por ubiquitina no está disponible como una opción de control de calidad, Ubc9 ts es inmediatamente redirigido a la inclusión IPOD para la agregación de protección. Estas herramientas ofrecen increíbles oportunidades para descubrir nuevos factores genéticos que intervienen en el control de calidad de agregación y de explorar su regulación espacial y temporal en la célula.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
References
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