4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen
Summary
Zelluläre Lebensfähigkeit hängt rechtzeitige und effiziente Verwaltung der Fehlfaltung von Proteinen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der unterschiedlichen potentiellen Schicksal eines fehlgefalteten Proteinen: Rückfaltung, Abbau oder Sequestrierung in Einschlüssen. Wir zeigen die Verwendung eines Falt-Sensor, Ubc9<sup> Ts</sup> Zur Überwachung proteostasis und Aggregation Qualitätskontrolle in lebenden Zellen mit Hilfe der 4D-Mikroskopie.
Abstract
Eine der wichtigsten Aufgaben jeder lebenden Zelle ist die Aufrechterhaltung der korrekten Faltung von neu synthetisierten Proteinen im Angesicht des sich ständig verändernden Umweltbedingungen und einer intrazellulären Umgebung, ist dicht gepackt, klebrig und gefährlich Proteinstabilität 1. Die Fähigkeit, dynamisch auszugleichen Protein-Produktion, Falt-und Abbau verlangt hoch spezialisierten Qualitätskontrolle Maschinen, deren absolute Notwendigkeit ist am besten, wenn es Störungen beobachtet. Krankheiten wie ALS, Alzheimer, Parkinson und bestimmte Formen der Mukoviszidose haben einen direkten Link zu Proteinfaltung Qualitätskontrolle Komponenten 2, und somit zukünftige therapeutische Entwicklung erfordert ein grundlegendes Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse. Unsere experimentelle Herausforderung ist, zu verstehen, wie Zellen Schäden Signale integrieren und montieren Antworten, die auf verschiedene Umstände zugeschnitten sind.
Der Hauptgrund, warum Proteinfehlfaltungen stellt eine existentielle threan der Zelle ist die Neigung von falsch gefalteten Proteinen zur Aggregation, wodurch eine globale Störung der überfüllten und zart intrazellulären Faltung Umgebung 1. Die Faltung der Gesundheit oder "proteostasis," der zellulären Proteoms wird beibehalten, auch unter dem Zwang der Alterung, Stress und oxidativen Schäden durch das koordinierte Handeln der verschiedenen mechanistischen Einheiten in einer aufwendigen Qualitätskontrolle 3,4. Eine spezielle Maschinen molekularer Chaperone können nicht-native Polypeptide binden und fördern deren Faltung in den nativen Zustand 1, zielen sie für den Abbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System 5 oder leiten sie an schützenden Aggregation Einschlüsse 6-9.
Die juxtanuclear Qualitätskontrolle Fach (JUNQ) und das unlösliche Protein Anzahlung (IPOD) (- Modell Abbildung 1): In Eukaryoten wird die cytosolische Aggregation Qualitätskontrolle Last zwischen zwei Fächern 8-10 unterteilt.Proteine, die durch das Protein Falzqualität Kontrollapparat ubiquitiniert werden an das JUNQ, wo sie für den Abbau durch das Proteasom verarbeitet geliefert. Falsch gefaltete Proteine, die nicht ubiquitiniert sind, werden auf dem IPOD, wo sie aktiv in einem schützenden Raum zusammengefasst werden umgeleitet.
Bis zu diesem Punkt hat die methodischen Paradigma der live-cell Fluoreszenzmikroskopie weitgehend Markierung von Proteinen gewesen und verfolgen ihre Orten in der Zelle an bestimmten Zeitpunkten und in der Regel in zwei Dimensionen. Wie neue Technologien begonnen haben zu gewähren Experimentatoren beispiellosen Zugang zu den Submikrometerbereich in lebenden Zellen, wurde die dynamische Architektur des Cytosol in Sicht als herausfordernde neue Grenze für experimentelle Charakterisierung kommen. Wir stellen eine Methode zum schnellen Überwachen der 3D räumlichen Verteilungen von mehrfachen fluoreszenzmarkierten Proteinen in der Hefe Cytosol über die Zeit. 3D timelapse (4D-Bildgebung) ist nicht nur eine technische Herausforderung, Rattesie, es erleichtert auch eine dramatische Verschiebung in den konzeptionellen Rahmen zur zellulären Struktur zu analysieren.
Wir verwenden eine cytosolische Falt-Sensor-Protein in lebende Hefe zu deutlichen Schicksale falsch gefalteten Proteinen in zellulären Aggregation Qualitätskontrolle zu visualisieren, mit schnellen 4D Fluoreszenz-Bildgebung. Die temperaturempfindliche Mutante des Proteins Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) ist extrem wirksam sowohl als Sensor der zellulären proteostasis und einem physiologischen Modell zum Verfolgen Aggregation Qualitätskontrolle. Wie bei den meisten ts Proteinen ist Ubc9 ts vollständig gefalteten und funktional permissiven Temperaturen durch aktive zelluläre Chaperone. Über 30 ° C, oder wenn die Zelle Fehlfaltung Stress, Ubc9 ts misfolds zugewandt und folgt dem Schicksal eines nativen globulären Protein, das fehlgefaltete hat aufgrund von Mutation, Hitzedenaturierung, oder oxidative Schädigung. Durch Fusion mit GFP oder andere Fluorophore, kann es in 3D verfolgt werden, wie es Stress-Foci bildet, oder ist dikorrigiert um JUNQ oder iPod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Intuitionen über biochemische Prozesse stammen aus Tischgerät Experimente, in denen ein gut gemischte Lösung der Reaktanten und Produkte dürfen Gleichgewicht in einem Becherglas zu erreichen ist. In einem solchen Szenario kann die Konzentration einer bestimmten chemischen Spezies als eine einzelne Zahl, die das Verhältnis einer molaren Menge von Molekülen mit einem makroskopischen Volumen ausgedrückt. Vieles, was wir über Proteinstruktur und-funktion stammt von Methoden, die das klassische, bulk Reaktion Bild widerspiegeln: Western Blots, Zentrifugationen und spektrophotometrischen Messungen an Extrakten aus Homogenaten von ganzen Populationen von Zellen durchgeführt.
Da die Technologie, die wir verwenden, um an Zellen unter Vergrößerung betrachten verbessert sprunghaft, wird es immer deutlicher, dass die Bedingungen, unter denen die meisten biochemischen Reaktionen in vivo nur die geringste Ähnlichkeit mit denen des klassischen Tischgerät Szenario tragen. Nicht nur ist der Innenraum des Cella dicht Umfeld verpackt, in dem Gedränge Effekte wesentlich verändern die Aktivitäten der verschiedenen Reaktanten, es ist auch genau das Gegenteil von gut gemischt. Dies erklärt die häufige Disparität zwischen in vitro und in vivo Wirkungsgrade einer Vielzahl von komplexen makromolekularen Reaktionen.
Nirgendwo sind Intuitionen, die aus klassischen in vitro biochemischen Experimenten anfälliger zu täuschen wie in Fragen rund um die in vivo Faltung, Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen. Nach den Untersuchungen der Proteinchemie in loser Schüttung Reaktionen das Problem der Falten für ein bestimmtes Protein als ein einfaches Ja oder Nein Frage behandeln kann, muss jeder Versuch, die Dynamik der gesamten Bevölkerung von Makromolekülen in einer lebenden Zelle zu verfolgen sensibel sein für die gesamte Verteilung der möglichen konformativen Ergebnisse verfügbar zu einer Polypeptidkette, insbesondere dem Risiko von Fehlfaltung und Aggregation. Zum Beispiel könnte untersuchen wir eine Bulk-Zelle lyübersättigen eines aggregierende Protein durch Western-Blotting, und bestimmen, dass das Protein überwiegend unlöslich und nicht ubiquitiniert ist. Jedoch in der lebenden Zelle eine diskrete Subpopulation des Proteins, schwer zu detektieren, wenn eine Mittelung über viele Zellen, kann löslich und ubiquitiniert in einem bestimmten Kompartiment wo die lokale Konzentration der Spezies ist extrem hoch. Das letztere Szenario kann mehr wichtige Konsequenzen für die Lebensfähigkeit der Zelle als der größere bulk Sub-Population. Weiterhin, während eine Vielzahl von Chaperone pleiotrope Verhaltensweisen und Funktionen in vitro zeigen, wird es immer deutlicher, dass in der Zelle ihre diskrete Funktionen räumlich und zeitlich begrenzt sind.
In der neu entstehenden Paradigma für das Verständnis der Biochemie, wird ein variabler Konzentration Eigenschaft jedes spezifische Nano-Umgebung, in der Zelle, und die molekularen Ereignisse, die biologische Prozesse zugrundeliegen muss nicht nur in Zeit getestet werden, sondern auch in spacE. Die 4D-Bildgebung hier vorgestellte Ansatz ermöglicht sensitive Modellierung Proteinfehlfaltungen in lebenden Zellen, aber es kann verwendet werden, um eine beliebige Anzahl von anderen biologischen Prozessen zu untersuchen und wie sie im Raum reguliert, Zeit und nach Änderungen der Umgebungsbedingungen. In diesem Papier verwenden wir den Ubc9 ts Falt-Sensor, der auf wirksame Weise zeigt die Phasen und Optionen für den Umgang mit dem Beginn der Proteinaggregation im Cytosol. Zusätzlich zu Veranschaulichung der Zellbiologie der Aggregation Qualitätskontrolle kann dieser Ansatz als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entschlüsselung die Wirkung von bestimmten Störungen oder genetische Mutationen auf proteostasis (beispielsweise Ubc9 ts kann zur Proteinfaltung Spannung in Reaktion auf Oxidation messen dienen, die Expression eines toxischen Zuschlagstoff oder Mutationen in der Qualitätskontrolle Weg).
4D-Bildgebung ist auch für die genaue Bestimmung von Protein Lokalisation oder Kolokalisation zwischen zwei verschiedenen Protein essentiells, und zum Erkennen Phänomene, die vielleicht nur vorübergehend, aber wichtig. Zum Beispiel, insbesondere bei einem kleinen kugelförmigen Organismus, wie Hefe, kann es den Anschein hat, dass eine Struktur oder aggregierter juxtanuclear Körperregion hat, während 4D-Bildgebung kann sich herausstellen, dass dies lediglich ein Artefakt des Winkels der Inspektion.
Im Beispiel experimentieren wir hier präsentieren, zeigen wir die Verwendung eines Modells fehlgefaltete Protein, Ubc9 ts, um die Aggregation Qualitätskontrolle über Zeit und Raum im Zytosol folgen. Bei der permissiven Temperatur wird Ubc9 ts gefaltet und diffundiert im Zellkern und Zytosol. Nach wärmeinduzierten Fehlfaltung, es bildet zunächst schnell diffundierenden kleinen Aggregat Stress-Foci, die für den proteasomalen Abbau verarbeitet werden. Wenn das Proteasom partiell gehemmt wird, werden diese Spannung Foci in JUNQ und IPOD Einschlüsse im Verlauf von etwa 2 Stunden umgesetzt. Wenn Ubiquitin-vermittelten Abbau ist nicht als eine Qualitätskontrolle Option Ubc9 ts wird sofort an den IPOD Einbeziehung schützende Aggregation umgeleitet. Diese Tools bieten unglaubliche Möglichkeiten, um neue genetische Faktoren in der Aggregation der Qualitätskontrolle beteiligt zu entdecken und ihre räumliche und zeitliche Regulation in der Zelle zu erforschen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
References
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