4D imagerie de l'agrégation des protéines dans les cellules vivantes
Summary
La viabilité cellulaire dépend de la prise en charge rapide et efficace des mauvais repliement des protéines. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser les différents destins possibles d'une protéine mal repliée: repliement, la dégradation ou la séquestration dans les inclusions. Nous démontrons l'utilisation d'un capteur de pliage, Ubc9<sup> Ts</sup>, Pour protéostasie suivi et contrôle de la qualité d'agrégation dans les cellules vivantes par microscopie 4D.
Abstract
L'une des tâches essentielles de toute cellule vivante est de maintenir le repliement correct des protéines nouvellement synthétisées dans un contexte de constante évolution des conditions environnementales et un environnement intracellulaire qui est serrés, collants et dangereux à 1 la stabilité des protéines. La capacité à équilibrer la production de protéines, de pliage et de la dégradation exige hautement spécialisé mécanisme de contrôle de la qualité, dont la nécessité absolue est observée mieux quand elle est en panne. Des maladies telles que la SLA, la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, et certaines formes de fibrose kystique ont un lien direct vers repliement des protéines, des composants de contrôle de qualité 2, et donc le futur développement thérapeutique nécessite une compréhension de base des processus sous-jacents. Notre défi expérimental est de comprendre comment les cellules intègrent les signaux des dommages et des ripostes adaptées aux diverses circonstances.
La raison principale pour laquelle les mauvais repliement des protéines représente un thre existentielleà la cellule est la propension des protéines mal repliées à l'ensemble, ce qui entraîne une perturbation globale de l'environnement encombré et délicat pliage intracellulaire 1. La santé pliage, ou «protéostasie», du protéome cellulaire est maintenu, même sous la contrainte de vieillissement, le stress et les dommages oxydatifs, par l'action coordonnée des différentes unités mécaniques dans un système de contrôle de la qualité élaborée 3,4. Une machinerie spécialisée des chaperons moléculaires peuvent se lier non indigènes polypeptides et de promouvoir leur pliage en l'état natif 1, les cibler pour la dégradation par le système ubiquitine-protéasome 5, ou les diriger vers des inclusions d'agrégation de protection 6-9.
Chez les eucaryotes, la charge d'agrégation cytosolique contrôle de la qualité est partagé entre deux compartiments 8-10: le compartiment de la qualité juxtanucléaire de commande (JUNQ) et le dépôt de protéines insolubles (IPOD) (Figure 1 – Modèle).Les protéines qui sont l'ubiquitine par la protéine contrôle de la qualité des machines de pliage sont livrés à l'JUNQ, où elles sont traitées pour la dégradation par le protéasome. Protéines mal repliées qui ne sont pas ubiquitine sont déviés vers l'IPOD, où ils sont activement regroupées dans un compartiment de protection.
Jusqu'à ce point, le paradigme méthodologique de cellules vivantes microscopie à fluorescence a été en grande partie aux protéines d'étiquettes et de suivre leurs emplacements dans la cellule spécifique points temporels et généralement en deux dimensions. Les nouvelles technologies ont commencé à accorder des expérimentateurs accès sans précédent à l'échelle submicronique dans les cellules vivantes, l'architecture dynamique du cytosol est venu en vue comme une difficile frontière pour la caractérisation expérimentale. Nous présentons une méthode pour contrôler rapidement les distributions spatiales 3D de plusieurs protéines marquées par fluorescence dans le cytosol de la levure au cours du temps. 3D timelapse (imagerie 4D) n'est pas seulement un défi technique; ratelle, elle facilite aussi un changement radical dans le cadre conceptuel utilisé pour analyser la structure cellulaire.
Nous utilisons une protéine cytosolique capteur de pliage en levures vivantes pour visualiser destins distincts pour les protéines mal repliées dans le contrôle de la qualité cellulaire agrégation, utilisant rapide 4D imagerie de fluorescence. Le mutant sensible à la température de la protéine Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) est extrêmement efficace à la fois comme capteur de proteostasis cellulaire, et un modèle physiologique de contrôle de qualité de suivi agrégation. Comme avec la plupart des protéines ts, ts Ubc9 est entièrement repliée et fonctionnel à des températures permissives en raison de chaperons cellulaires actifs. Au-dessus de 30 ° C, ou lorsque la cellule est confrontée le stress repliement, Ubc9 misfolds ts et suit le destin d'une protéine globulaire native qui a été mal repliées due à une mutation, dénaturation par la chaleur, ou les dommages oxydatifs. En fusionnant la GFP ou à l'd'autres fluorophores, il peut être suivi en 3D car elle constitue stress foyers, ou est-directed à JUNQ ou IPOD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos intuitions sur les processus biochimiques tirer des expériences paillasse dans lequel une solution bien mélangée de réactifs et de produits est autorisé à atteindre l'équilibre dans un bécher. Dans un tel contexte, la concentration d'une espèce chimique donnée peut être exprimée par un seul nombre, qui est le rapport d'une quantité molaire de molécules dans un volume macroscopique. Une grande partie de ce que nous savons à propos de la structure des protéines et la fonction découle de l'utilisation de méthodes qui reflètent le classique, image réaction en masse: western blots, des centrifugations, et les mesures spectrophotométriques effectuées sur des extraits de homogénats de populations entières de cellules.
Comme la technologie que nous utilisons pour observer les cellules sous un grossissement améliore à pas de géant, il devient de plus en plus clair que les conditions dans lesquelles la plupart des réactions biochimiques se déroulent in vivo portent seulement la moindre ressemblance avec ceux du scénario de paillasse classique. Non seulement l'intérieur de la cella dense environnement, dans lequel les effets d'éviction modifier substantiellement les activités de divers réactifs, il est également tout à fait à l'opposé de bien mélangée. C'est ce qui explique la disparité fréquente entre in vitro et in vivo l'efficacité d'un large éventail de réactions complexes macromoléculaires.
Nulle part sont des intuitions issues de la musique classique dans des expériences biochimiques in vitro plus enclins à induire en erreur quant aux questions relatives à la dans le repliement in vivo, mauvais repliement et l'agrégation des protéines. Alors que les études de chimie des protéines dans les réactions en vrac peut traiter la question de pliage pour une protéine donnée comme un simple oui ou par non, toute tentative de suivre la dynamique des populations entières de macromolécules dans une cellule vivante doit être sensible à la distribution de l'ensemble possible conformationnels résultats disponibles pour une chaîne polypeptidique, et en particulier pour le risque de mauvais repliement et l'agrégation. Par exemple, nous pourrions examiner une cellule ment en vracsate agrégation d'une protéine par Western blot, et de déterminer que la protéine est essentiellement insoluble et non ubiquitinée. Cependant, dans la cellule vivante d'un discret sous-population de la protéine, difficile à détecter quand la moyenne sur de nombreuses cellules, peuvent être solubles et ubiquitinée dans un compartiment particulier lorsque la concentration locale de l'espèce est extrêmement élevé. Ce dernier scénario pourrait avoir des conséquences plus importantes pour la viabilité de la cellule que la plus grande masse sous-population. En outre, alors que les accompagnateurs présentent une variété de comportements pléiotropes et fonctions in vitro, il devient évident que, dans la cellule de leurs fonctions discrètes sont spatialement et temporellement limité.
Dans le nouveau paradigme pour comprendre la biochimie, la concentration devient une propriété de variable spécifique de chaque nano-environnement dans la cellule, et les événements moléculaires qui sous-tendent les processus biologiques doivent être analysés non seulement dans le temps, mais aussi dans space. L'approche d'imagerie 4D présentée ici permet la modélisation sensible du mauvais repliement des protéines dans les cellules vivantes, même si elle peut être utilisée pour étudier un certain nombre d'autres processus biologiques et la façon dont ils sont réglementés dans l'espace, le temps et la suite de changements dans les conditions environnementales. Dans ce document, nous utilisons le capteur ts Ubc9 pliage, ce qui montre bien les étapes et les options pour faire face à l'apparition de l'agrégation des protéines dans le cytosol. En plus d'illustrer la biologie cellulaire de contrôle de la qualité d'agrégation, cette approche peut servir comme un outil puissant pour déchiffrer l'effet des perturbations ou des mutations génétiques sur protéostasie (par exemple Ubc9 ts peut être utilisé pour mesurer le stress repliement des protéines en réponse à l'oxydation, l'expression d'un agrégat toxique, ou des mutations dans la voie de contrôle de la qualité).
L'imagerie 4D est également essentiel pour déterminer avec précision la localisation des protéines ou colocalisation entre deux protéines différentess, et pour détecter des phénomènes qui peut être transitoire mais importante. Par exemple, surtout dans un petit organisme sphérique comme la levure, il peut sembler être le cas que d'une structure ou d'un agrégat possède localisation juxtanucléaire, alors que l'imagerie 4D peut révéler que ce n'est tout simplement un artefact de l'angle de l'inspection.
Dans l'expérience par exemple que nous présentons ici, nous démontrons l'utilisation d'un modèle mal repliées des protéines, Ubc9 ts, de suivre l'agrégation contrôle de la qualité au fil du temps et de l'espace dans le cytosol. À la température permissive, Ubc9 ts est pliée et diffusé dans le cytosol et le noyau. Lors de la chaleur induite par repliement, il forme d'abord rapidement diffuser des petits foyers de stress globaux qui sont traitées à la dégradation par le protéasome. Lorsque le protéasome est inhibée partiellement, ces foyers de tension sont convertis en JUNQ et inclusions IPOD au cours de l'ordre de 2 h. Si l'ubiquitine dégradation n'est pas disponible comme une option de contrôle de la qualité, Ubc9 ts est ré-acheminé immédiatement à l'inclusion IPOD pour l'agrégation de protection. Ces outils offrent des possibilités incroyables à découvrir de nouveaux facteurs génétiques impliqués dans le contrôle de la qualité d'agrégation, et d'étudier leur régulation spatiale et temporelle dans la cellule.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
References
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