Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas
Summary
Viabilidade celular depende de uma gestão eficiente e oportuna de misfolding proteína. Descrevemos aqui um método para a visualização dos diferentes destinos potenciais de uma proteína misfolded: redobramento, degradação, ou sequestração de inclusões. Nós demonstramos a utilização de um sensor de dobragem, Ubc9<sup> Ts</sup>, Por proteostasis monitoramento e controle de qualidade em agregação de células vivas usando microscopia 4D.
Abstract
Uma das tarefas-chave de qualquer célula viva é manter a dobradura adequada de proteínas recém-sintetizadas em face da constante mudança das condições ambientais e de um ambiente intracelular que é hermeticamente embalados, pegajoso, e perigosos para a estabilidade da proteína 1. A capacidade de equilibrar dinamicamente a produção de proteínas, dobradura e degradação exige altamente especializado de máquinas de controle de qualidade, cuja absoluta necessidade é observada melhor quando avarias. Doenças como a esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, de Parkinson, e certas formas de fibrose cística tem um link direto para proteínas componentes de qualidade dobráveis de controle 2 e, portanto, o futuro desenvolvimento terapêutico requer um conhecimento básico de processos subjacentes. Nosso desafio experimental é entender como as células integram sinais de danos e de encontrar respostas que são adaptados às diversas circunstâncias.
A principal razão pela qual misfolding proteína representa um thre existencialem que a célula é a propensão de proteínas incorrectamente dobradas para agregado, causando assim uma perturbação global do aglomerado e delicado ambiente intracelular de dobragem 1. A saúde dobrar, ou "proteostasis", do proteoma celular é mantida, mesmo sob a pressão do envelhecimento, estresse e dano oxidativo, pela ação coordenada de diferentes unidades mecanicistas em um elaborado sistema de controle de qualidade 3,4. A maquinaria especializada de chaperonas moleculares podem ligar polipeptídeos não nativos e promover a sua dobragem para o estado nativo 1, orientá-las para a degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma 5, ou encaminhá-los para inclusões de agregação de protecção 6-9.
Em eucariotas, a agregação de carga citosólica de controlo de qualidade é partilhado entre dois compartimentos 8-10: o compartimento de controle de qualidade juxtanuclear (JUNQ) e do depósito de proteína insolúvel (IPOD) (Figura 1 – modelo).Proteínas que são ubiquitinadas pelo mecanismo de controlo de qualidade de proteínas de dobragem são entregues ao JUNQ, onde eles são tratados para degradação pelo proteassoma. Proteínas deformadas que não são ubiquitinadas são desviadas para o iPod, onde eles estão ativamente agregadas em um compartimento de proteção.
Até este ponto, o paradigma metodológico de live-célula de microscopia de fluorescência tem sido largamente às proteínas de etiqueta e rastrear suas localizações na célula específica em tempo de pontos e, geralmente, em duas dimensões. Como as novas tecnologias começaram a conceder experimentadores acesso sem precedentes à escala submicron em células vivas, a arquitetura dinâmica do citosol veio vista como uma fronteira novo e desafiador para a caracterização experimental. Apresenta-se um método para monitorizar rapidamente as distribuições espaciais em 3D de múltiplas proteínas marcadas com fluorescência no citosol de leveduras ao longo do tempo. Timelapse 3D (imagens 4D) não é apenas um desafio técnico; ratoela, também facilita uma mudança dramática na estrutura conceitual usada para analisar a estrutura celular.
Utilizamos uma proteína citosólica do sensor de dobragem em levedura viva para visualizar destinos diferentes para proteínas deformadas no controle de qualidade celular agregação, utilizando imagiologia 4D rápida fluorescente. O mutante sensível à temperatura da proteína Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) é extremamente eficaz, tanto como um sensor de proteostasis celular, e um modelo fisiológico para controle de rastreamento agregação qualidade. Tal como acontece com a maioria das proteínas ts, ts Ubc9 é totalmente dobrada e funcional, a temperaturas permissivas, devido à activas chaperones celulares. Acima de 30 ° C, ou quando a célula enfrenta estresse misfolding, Ubc9 misfolds ts e segue o destino de uma proteína nativa globular que foi misfolded devido a mutação, a desnaturação pelo calor, ou o dano oxidativo. Ao fundir a GFP ou fluoróforos outros, que podem ser rastreados em 3D, como se forma stress Foci, ou é didirigido a JUNQ ou iPod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nossas intuições sobre processos bioquímicos derivar a partir de experiências de bancada de topo em que uma solução bem misturada dos reagentes e produtos é permitido para atingir o equilíbrio num copo. Em tal situação, a concentração de uma espécie química dadas pode ser expresso como um número único, que é a razão entre a quantidade molar de moléculas a um volume macroscópico. Muito do que sabemos sobre a estrutura e função das proteínas deriva da utilização de métodos que refletem o clássico, imagem reação em massa: borrões ocidentais, centrifugações e medições espectrofotométricas realizadas em extratos de homogeneizados de populações inteiras de células.
Como a tecnologia que usamos para olhar para as células sob a ampliação melhora aos trancos e barrancos, torna-se cada vez mais claro que as condições em que a maioria das reações bioquímicas ocorrem in vivo ter apenas a menor semelhança aos do cenário clássico de bancada. Não só é o interior da cella densamente ambiente, em que os efeitos aglomeração altera substancialmente as actividades dos vários reagentes, também é o oposto de bem misturado. Isso explica a disparidade frequente entre in vitro e in vivo em eficiências de uma grande variedade de reacções macromoleculares complexos.
Em nenhum lugar são intuições decorrentes de experimentos in vitro clássica bioquímicos mais propensas a enganar como em questões referentes ao vivo em dobrar, misfolding e agregação de proteínas. Considerando que os estudos de química de proteínas em reações em massa pode tratar a questão de dobrar para uma determinada proteína como um simples sim ou não questão, qualquer tentativa de acompanhar a dinâmica de populações inteiras de macromoléculas em uma célula viva deve ser sensível a toda a distribuição de possíveis resultados conformacionais disponíveis para uma cadeia polipeptídica, e em particular para o risco de misfolding e agregação. Por exemplo, podemos examinar uma célula ly grossosate a agregação de uma proteína de transferência de western, e determinar que a proteína é essencialmente insolúvel e não ubiquitinated. No entanto, em células vivas de um discreto sub-população da proteína, é difícil detectar quando a média sobre muitas células, podem ser solúveis e ubiquitinated num compartimento especial, quando a concentração local das espécies é extremamente elevado. O último caso pode ter consequências mais importantes para a viabilidade da célula do que a maior massa sub-população. Além disso, enquanto chaperones exibir uma variedade de comportamentos e funções pleiotrópicas, in vitro, torna-se evidente que, na célula suas funções discretas são espacialmente e temporalmente limitado.
No paradigma emergente para a compreensão da bioquímica, a concentração se torna uma propriedade de cada variável específica nano-ambiente na célula, e os acontecimentos moleculares que estão na base dos processos biológicos devem ser ensaiadas não apenas no tempo, mas também em space. A imagiologia 4D abordagem aqui apresentada permite a modelagem sensível do enrolamento incorrecto da proteína em células vivas, no entanto, pode ser usado para estudar qualquer número de outros processos biológicos e de como eles são regulados no espaço, o tempo, e na sequência de alterações das condições ambientais. Neste trabalho, o uso do sensor Ubc9 ts dobrável, que demonstra eficazmente as fases e as opções para se lidar com o início da agregação de proteínas no citosol. Além de ilustrar a biologia celular de agregação de controlo de qualidade, esta abordagem pode servir como uma ferramenta poderosa para decifrar o efeito das perturbações específicas ou mutações genéticas em proteostasis (por exemplo Ubc9 ts podem ser usados para medir a proteína de stress de dobragem em resposta à oxidação, a expressão de um agregado tóxico, ou mutações na via de controlo de qualidade).
Formação de imagens 4D também é essencial para determinar com precisão a localização de proteínas ou de co-localização entre duas proteínas diferentess, e para a detecção de fenômenos que talvez ser transitórios, mas importante. Por exemplo, especialmente em um pequeno organismo esférico, tais como levedura, que pode parecer ser o caso de que uma estrutura ou agregado tem localização juxtanuclear, enquanto que imagens 4D pode revelar que este é simplesmente um artefacto do ângulo de inspecção.
No experimento de exemplo apresenta-se aqui, que demonstram a utilização de um modelo de proteína misfolded, Ubc9 ts, a seguir a agregação de controle de qualidade ao longo do tempo e espaço no citosol. À temperatura permissiva, Ubc9 ts é dobrada e difundida no núcleo e citosol. Após induzida pelo calor misfolding, inicialmente forma rápida difusão de focos pequenos agregados de estresse que são processados para a degradação proteosomal. Quando o proteassoma é parcialmente inibida, estes focos de stress são convertidos em JUNQ e inclusões IPOD ao longo de cerca de 2 horas. Se degradação mediada por ubiquitina não está disponível como uma opção de controlo de qualidade, Ubc9 ts é imediatamente redirecionado para a inclusão IPOD para agregação de proteção. Essas ferramentas oferecem oportunidades incríveis para descobrir novos fatores genéticos envolvidos na agregação de controle de qualidade, e explorar a sua regulação espacial e temporal na célula.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
References
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