4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים
Summary
כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל, Ubc9<sup> Ts</sup>, לproteostasis ניטור ובקרת איכות צבירה בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ 4D.
Abstract
One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer’s, Parkinson’s, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or “proteostasis,” of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 – model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 °C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.
Protocol
Representative Results
Discussion
האינטואיציות שלנו על תהליכים ביוכימיים נובעות מניסויים גבי ספסל שבו פתרון מעורב ושל מגיבים ומוצרים רשאי להגיע לשיווי משקל בכוס. בהגדרה כזו, הריכוז של תרכובות כימיות הניתנות עלול להתבטא במספר אחד, שהוא היחס בין כמות טוחנת של מולקולות לנפח מקרוסקופית. הרבה ממה שאנו יודעים על מבנה חלבון ותפקוד נובע משימוש בשיטות המשקפות את התמונה הקלסית, עיקר תגובה: כתמים מערביים, centrifugations ומידות spectrophotometric בוצעו על תמציות מhomogenates של אוכלוסיות שלמות של תאים.
ככל שהטכנולוגיה שאנו משתמשים להסתכל על תאים בהגדלה משפר בקפיצות, הוא הופך להיות ברור יותר מתמיד כי תנאים שבתגובות ביוכימיות ביותר מתרחשות בגוף חי נושאים רק דמיון הקלוש לאלה של התרחיש גבי הספסל הקלסי. לא רק הפנים של celלה צפוף סביבה, שבו צפיפות השפעות משמעותיות לשנות את פעילותם של מגיבים שונים, זה גם די ההפך ממעורב ו. דבר זה מסביר את הפער התדיר בין במבחנה ביעילות vivo של מגוון רחב של תגובות macromolecular מורכבות.
בשום מקום הן נובעות מאינטואיציות קלסיות בניסויי מבחנה ביוכימיים נוטים יותר להטעות כמו בשאלות הנוגעות לקיפול vivo, misfolding, וצבירה של חלבונים. בעוד שמחקרים של כימית חלבון בתגובות בתפזורת יכולים לטפל בנושא של קיפול לחלבון ניתן כפשוטים כן או לא שאלה, כל ניסיון לעקוב אחר הדינמיקה של אוכלוסיות שלמות של מקרומולקולות בתא חי חייב להיות רגיש לכל ההפצה אפשרית תוצאות קונפורמציה זמינות לשרשרת פוליפפטיד, ובפרט לסיכון של misfolding וצבירה. לדוגמה, אנו יכולים לבחון ly תא תפזורתלהשביע של חלבון על ידי צבירה מערבית סופג, ולקבוע כי החלבון הוא בעיקר מסיס ולא ubiquitinated. עם זאת, בתא החי תת אוכלוסייה דיסקרטית של החלבון, קשה לזהות כאשר הממוצע מעל תאים רבים, עשוי להיות מסיס וubiquitinated בתא מסוים שבו הריכוז המקומי של המינים הוא גבוה ביותר. התרחיש זה האחרון עשוי להיות השלכות חשובות יותר לחיוניות של התא מתת אוכלוסיית התפזורת הגדולה יותר. יתרה מכך, בעוד מלווים להציג מגוון רחב של התנהגויות ותפקודים במבחנה pleiotropic, זה הופך ברור כי בתא הפונקציות הבדידות מוגבלות מרחב ובזמן.
בפרדיגמה החדשה הלהבנת הביוכימיה, ריכוז הופך לרכושו של כל משתנה ננו סביבה מסוימת בתא, ואת האירועים המולקולריים שבבסיס תהליכים ביולוגיים יש assayed לא רק בזמן, אלא גם בSPACדואר. גישת הדמית 4D הוצגה כאן מאפשרת מודלים רגישים של misfolding חלבון בתאים חיים, אם כי ניתן להשתמש בו כדי ללמוד על כל מספר התהליכים ביולוגיים אחרים וכיצד הם מוסדרים במרחב, זמן, ובעקבות שינויים בתנאי הסביבה. במאמר זה אנו משתמשים בחיישן Ubc9 ts מתקפל, אשר למעשה מדגים את השלבים ואפשרויות להתמודדות עם ההתפרצות של צבירת חלבון בcytosol. בנוסף לממחיש את הביולוגיה של התא של בקרת איכות צבירה, גישה זו יכולה לשמש ככלי רב עצמה לפענוח ההשפעה של הפרעות ספציפיות או מוטציות גנטיות בproteostasis (לדוגמא Ubc9 ts יכול לשמש למדידת לחץ קיפול חלבונים בתגובה לחמצון, הביטוי לצבירה רעילה, או מוטציות במסלול בקרת האיכות).
4D הדמיה חיונית גם לקביעת לוקליזציה חלבון או החלבון colocalization בין שתי שונים במדויקs, ולאיתור תופעות שאולי להיות חולף אך חשוב. לדוגמה, במיוחד באורגניזם כדורי קטן כמו שמרים, זה עשוי להיראות במקרה שמבנה או המצרפי יש לוקליזציה juxtanuclear, בעוד 4D הדמיה יכולה לגלות שזה פשוט תוצר של הזווית של בדיקה.
בניסוי לדוגמא אנו מציגים כאן, אנו מדגימים את השימוש במודל misfolded חלבון, Ubc9 TS, לעקוב בקרת איכות הצטברות לאורך זמן ובמרחב בcytosol. בטמפרטורה המתירנית, Ubc9 ts מקופל ומתפזר בגרעין וcytosol. על misfolding נגרם עקב החום, זה יוצר תחילה במהירות מוקדי diffusing קטנים מצטברים מתח שעוברים עיבוד לפירוק proteasomal. כאשר הפרוטאזום חלקית עכבות, מוקדי מתח אלה מומרים לJUNQ ותכלילים IPOD במשך כ 2 שעות. אם שפלת יוביקוויטין בתיווך אינה זמינה כאפשרות בקרת איכות, UBC9 ts מחדש מנותב מייד להכללת IPOD לצבירת מגן. כלים אלה מציעים הזדמנויות מדהימות לגלות גורמים גנטיים מעורבים ברומן בקרת איכות צבירה, ולחקור הסדרת המרחב ובזמנם בתא.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| MG132 | Mercury | mbs474790 | |
| con A | Sigma | C2010 | |
| Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
| 4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |
References
- Gershenson, A., Gierasch, L. M. Protein folding in the cell: challenges and progress. Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).
- Aguzzi, A., Calella, A. M. Prions: protein aggregation and infectious diseases. Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).
- Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & development. 22, 1427-14 (2008).
- Cohen, E., Dillin, A. The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration. Nature reviews. Neuroscience. , (2008).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, (1998).
- Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews. Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).
- Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?. Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).
- Spokoini, R., et al. Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast. Cell Rep. , (2012).
- Weisberg, S. J., et al. Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).
- Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments. Nature. 454, 1088 (2008).
- Betting, J., Seufert, W. A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway. The Journal of biological chemistry. 271, 25790 (1996).
- Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal. Analytical biochemistry. 272, 263 (1999).
