Lavado broncoalveolar (BAL) de Investigación; obtención de rendimiento adecuado de la muestra

1. Los sujetos son recibidos a su llegada por la Enfermera de Investigación Respiratoria El tema ha estado ayunando durante> 4 horas para alimentos sólidos y 2 h para líquidos claros 1. El procedimiento se realiza como un caso de día con los controles pre y post-procedimiento adecuado (según la política del hospital estándar). El sujeto lleva una bata de hospital. Se inserta una pequeña cánula de calibre (lo ideal es en la mano izquierda) y se mantiene in situ hasta el final del período de recuperación después del procedimiento 1. Se toman observaciones previos al procedimiento (presión arterial, frecuencia cardíaca, saturación de oxígeno [SATS]). El sujeto se transfiere a la suite de la broncoscopia. 2. El sujeto está preparada para el procedimiento en la suite por una Investigación Clínico Respiratorio Con experiencia en broncoscopia Los equipos de inspección se adjunta incluyendo; 3 derivaciones ECG, oxímetro de pulso 1,10 y esfigmomanómetro. AnesthetNo se necesita apoyo ic incluyendo el consentimiento informado por escrito. El oxígeno se puede suministrar a través de una cánula nasal con hasta 4 L / min, para lograr SAT> 90% 1. El operador comprueba el broncoscopio, esto incluye asegurarse de succión efectiva mediante la aspiración de solución salina normal estéril. La anestesia tópica con lidocaína se consigue en los pasajes nasales (utilizando Instillagel 1) y la mucosa oral (utilizando xilocaína) Si la sedación es apropiada y solicitado por el sujeto, el midazolam se administra por vía intravenosa 1. Un agente de inversión apropiado (flumazenil) está disponible inmediatamente. El equipo de reanimación debe estar disponible 1,10. 3. El broncoscopio es insertado y posicionado La intubación es por lo general a través de la nariz. Si esto no es posible debido a pólipos nasales, cornetes inflamados, o cualquier molestia entonces el sujeto es intubado a través de la boca (un protector bucal se utiliza para prevenirdaños en el alcance o los dientes del sujeto). La anestesia tópica en la laringe se completa utilizando 4% de lidocaína, por lo general se utiliza un total de 4-6 ml. Comúnmente esto causa la tos en la instilación. Se pasan las cuerdas vocales, y otros que utilizan la anestesia de la mucosa de 2 ml de lidocaína al 2% en la carina, en la división del lóbulo inferior derecho (RLL) y lóbulo medio derecho (RML) y en la entrada RML. El broncoscopio se coloca dentro de la RML, idealmente en el segmento medial, en una posición en la que es suficiente para estar en una posición segura distal pero no demasiado distal de modo que la vía respiratoria se derrumba cuando se aplica succión ("prueba de Wink 'utilizando el botón de aspiración ). Una buena posición es indicada durante la prueba guiño mediante un broncoscopio que se puede mantener totalmente en posición por el broncoscopista y una vía aérea que no lo hace totalmente cierran inmediatamente una succión suave. 4. El BAL se realiza Cuatro 60 ml jeringas son prelleno con solución salina normal calentada – 60 ml, 50 ml, 50 ml, y 40 ml en jeringas sucesivas. Cuando el sujeto y broncoscopista están listos la primera jeringa de solución salina se instila por el asistente broncoscopia mientras broncoscopista mantiene la posición en la RML. Succión suave mano se lleva a cabo a continuación por el asistente utilizando el mismo puerto y 50 ml jeringa. Este procedimiento se repite entonces una 3x aún más, con un volumen máximo de 200 ml utilizados en nuestra técnica específica. El BAL líquido recuperado se expulsa suavemente en recipientes etiquetados que ya se encuentren en la fusión del hielo. Los recipientes de vidrio pueden ser presiliconized el fin de inhibir la unión de células y maximizar el rendimiento celular. El fluido BAL aparece nebuloso contra la luz con las burbujas de jabón de superficie formadas por tensioactivos. El broncoscopio se retira lentamente plenamente. El BAL líquido se transporta sin demora en hielo para su procesamiento inmediato. 5. Asunto Recuperación </p> El sujeto se recupera para 2-4 horas por la enfermera de la investigación respiratoria en una sala. Durante este tiempo se les permite descansar y sólo comer y beber> 60 min 1 después del procedimiento (cuando su deglución es evaluado como seguro), con el fin de reducir el riesgo de aspiración. Observaciones posteriores al procedimiento son controlados y registrados. Un examen clínico se produce antes de la descarga. El sujeto se informó predescarga acerca de los efectos secundarios comunes (fiebre, dolor de pecho submamaria derecha leve, dolor de garganta) y se le dio un número de contacto en caso de efectos secundarios significativos se producen 1. El sujeto se dio seguimiento en 1-5 días después del procedimiento con un contacto clínico. Esto puede ser o bien por teléfono o en persona. 6. Las células se aíslan en el laboratorio – Realizar el deshielo, cuando sea posible El volumen de líquido de BAL se registra y se filtró a través de una doble capa de gasa estéril hisopopara quitar los tapones de moco en, tubos de 50 ml centrífuga estériles preenfriados. Las células se sedimentaron por centrifugación a 500 xg a 4 ° C durante 5-10 minutos y se lavaron por agitación en 50 ml de frío de solución salina normal. Centrifugación se repite una vez. Las células se resuspenden en medio de cultivo (RPMI-1640 + suero bovino fetal al 10% + 2 mM de L-glutamina + penicilina [40 UI / ml], estreptomicina [75 UI / ml], y la anfotericina B [0,5 UI / ml]) y recuento diferencial realizado usando un volumen igual de azul de tripano y un hemocitómetro. La suspensión celular se normaliza a la densidad requerida (usamos 1 x 10 6 células / ml), introducidos con la pipeta en placas de cultivo tisular adecuada y se incuban a 37 ° C durante 3 horas para permitir la adherencia de macrófagos. 1 ml de esta suspensión celular por pocillo es apropiado para placas de cultivo de 24 pocillos. Para el trabajo de linfocitos, después de 3 horas de incubación, el medio de cultivo se pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo de 3 aumentos, y se recoge. Este medio contiene linfocitosy los macrófagos no adherentes y se pueden utilizar para evaluar la función de linfocitos, sino que también se puede utilizar en etapas de purificación, por ejemplo con perlas magnéticas CD14 para eliminar los macrófagos. Para el trabajo de los macrófagos, después de 3 h de incubación, el medio se retira cuidadosamente con un mínimo de pipeteo y se reemplaza con medio fresco, caliente sin antibióticos (RPMI 1640 + 10% de suero bovino fetal + 2 mM de L-glutamina). Los macrófagos son adherentes a la placa de cultivo de tejidos (véase la Figura 1).