Lavage broncho-alvéolaire (LBA) pour la recherche; obtention adéquate rendement de l'échantillon

Une. Les sujets sont accueillis à leur arrivée par l'infirmière de recherche en santé respiratoire Le sujet a été à jeun depuis> 4 h pour les aliments solides et 2 h pour les liquides clairs 1. La procédure est réalisée comme un cas de jour avec des contrôles pré-et post-procédure appropriée (conformément à la politique standard de l'hôpital). Le sujet porte une chemise d'hôpital. Une canule de petit calibre est inséré (de préférence dans la main gauche) et reste en place jusqu'à la fin de la période de récupération post-procédure 1. Observations préprocédure sont prises (pression artérielle, fréquence cardiaque, saturation en oxygène [des] sats). Le sujet est transféré à la suite de la bronchoscopie. 2. Le sujet est-elle prête pour la procédure dans la suite par une recherche des cliniciens expérimentés dans respiratoire bronchoscopie L'équipement de surveillance est fixée notamment; 3 ECG, oxymètre de pouls 1,10 et sphygmomanomètre. Anesthésiqueappui d'ic n'est pas nécessaire, y compris le consentement éclairé. L'oxygène peut être administré via une canule nasale jusqu'à 4 L / min, pour atteindre sats> 90% 1. L'opérateur vérifie le bronchoscope, cela implique d'assurer aspiration efficace en aspirant une solution saline normale stérile. L'anesthésie topique avec de la lidocaïne est atteint dans les voies nasales (en utilisant Instillagel 1) et de la muqueuse buccale (à l'aide de la xylocaïne) Si la sédation est approprié et demandé par le sujet, le midazolam par voie intraveineuse est administré 1. Un agent de renversement approprié (flumazénil) est immédiatement disponible. Matériel de réanimation doit être disponible immédiatement 1,10. 3. Le bronchoscope est insérée et positionnée Intubation est généralement par le nez. Si ce n'est pas possible en raison de polypes nasaux, cornets enflammées, ou tout inconfort alors le sujet est intubé par la bouche (bouche-garde est utilisé pour prévenirnuire à la portée ou les dents de l'objet). L'anesthésie topique au niveau du larynx est réalisée en utilisant 4% de lidocaïne, généralement un total de 4-6 ml est utilisé. Généralement ce qui provoque la toux sur instillation. Les cordes vocales sont passés, et d'autres l'anesthésie de la muqueuse à l'aide de fractions de 2 ml de lidocaïne 2% à la carène, à la division du lobe inférieur droit (RLL) et lobe moyen droit (RML) et à l'entrée RML. Le bronchoscope est positionné à l'intérieur de la RML, de préférence dans le segment médian, dans une position où il suffit d'être dans une position sûre distale mais pas trop distale de telle sorte que les voies aériennes s'effondre lorsque l'aspiration est appliquée («test Clin 'à l'aide du bouton d'aspiration ). Bon positionnement est indiqué lors de l'essai de clin d'oeil d'un bronchoscope qui peut être entièrement maintenue en position par le bronchoscopiste et les voies respiratoires qui ne se ferme pas complètement immédiatement aspiration douce. 4. Le BAL est joué Quatre 60 ml seringues sont prérempli de solution saline normale réchauffé – 60 ml, 50 ml, 50 ml et 40 ml dans des seringues successives. Lorsque le sujet et sont prêts bronchoscopiste la première seringue de sérum physiologique est inculquée par l'assistant de bronchoscopie tandis que le bronchoscopiste maintient la position dans la RML. Aspiration de main douce est ensuite effectuée par l'assistant en utilisant le même port et seringue de 50 ml. Cette procédure est ensuite répétée en outre un 3x, avec un volume maximal de 200 ml utilisées dans notre technique spécifique. Le fluide BAL récupéré est ensuite expulsé doucement dans des conteneurs appropriés ont déjà eu lieu sur la fonte des glaces. Les récipients en verre peuvent être presiliconized afin d'inhiber la fixation cellulaire et de maximiser le rendement de la cellule. Le LBA semble brumeuse contre la lumière avec des bulles de savon de surface formés par des agents tensioactifs. Le bronchoscope est entièrement retirée lentement. Le LBA est transporté sans délai sur la glace pour un traitement immédiat. 5. Récupération Sujet </p> Le sujet est récupérée pour 2-4 heures par l'infirmière de recherche en santé respiratoire dans un service. Pendant ce temps, ils sont autorisés à se reposer et seulement manger et boire> 60 min 1 après la procédure (lorsque leur hirondelle est évaluée comme sûr), afin de réduire les risques d'aspiration. Observations poste de procédure sont surveillés et enregistrés. Un examen clinique se produit avant la décharge. Le sujet est informé prédécharge quant aux effets secondaires courants (fièvre, doux droit submammary gêne thoracique, mal de gorge) et un numéro de contact en cas d'effets secondaires importants se produisent 1. Le sujet est un suivi à 1-5 jours après l'intervention d'un contact clinique. Cela peut être soit par téléphone ou en personne. 6. Les cellules sont isolés en laboratoire – Effectuer sur fonte des glaces, si possible, Le volume de fluide BAL est enregistré et filtré à travers une double couche de tampon de gaze stérilepour enlever les bouchons de mucus dans prérefroidie, tubes de 50 ml à centrifuger stériles. Les cellules sont sédimentées par centrifugation à 500 xg à 4 ° C pendant 5 à 10 min et lavées par vortex dans 50 ml de solution saline normale à froid. Centrifugation est répétée une fois. Les cellules sont remises en suspension dans du milieu de culture (RPMI-1640 + 10% de sérum bovin foetal + 2 mM de L-glutamine + pénicilline [40 UI / ml], de la streptomycine [75 UI / ml], et de l'amphotéricine B [0,5 UI / ml]) et comptage différentiel effectuée en utilisant un volume égal de bleu trypan et un hémocytomètre. La suspension cellulaire est normalisée à la densité requise (on utilise 1 x 10 6 cellules / ml), introduit à la pipette dans des plaques de culture tissulaire appropriées, et incubées à 37 ° C pendant 3 heures pour permettre l'adhérence des macrophages. 1 ml de cette suspension de cellules par puits est approprié pour des plaques de culture à 24 puits. Pour le travail de lymphocytes, après 3 h d'incubation, le milieu de culture est doucement à la pipette de haut en bas 3x, et recueilli. Ce milieu contient les lymphocyteset les macrophages non adhérentes et peut être utilisé pour évaluer la fonction des lymphocytes, il peut aussi être utilisé dans les étapes de purification, par exemple avec des billes magnétiques CD14 pour éliminer les macrophages. Pour le travail macrophage, après 3 h d'incubation, le milieu est soigneusement retiré avec un minimum de pipetage et remplacé par du frais, chaud milieu sans antibiotiques (RPMI 1640 + 10% de sérum bovin foetal + 2 mM de L-glutamine). Les macrophages sont adhérents à la plaque de culture de tissus (voir la figure 1).