Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları
Summary
Bu protokol, biz görüntüleme Ca son gelişmeleri güncellemek<sup> 2 +</supBir kırmızı floresan Ca kullanarak beyin dokusunda dilimler GFP etiketli nöronlar> sinyalleri<sup> 2 +</sup> Gösterge boyası.
Abstract
Beyinde bilgi kodlama, kesin moleküler adımları yanı sıra hipotalamus kalır gibi beyin bölgelerinin çok fonksiyonlu çekirdekler belirli nöronların aktivitesi açısından merkezi bir soru altında yatan mekanizmalar hakkında bilgimiz çok büyük bir artış olmasına rağmen. Bu sorun, çeşitli nevrohormondur sinyal iletim cascades düzenlenmesinde rol oynayan moleküler bileşenlerin tanımlanmasını içerir. Hücre içi Ca2 + yükselmesi iki sinyal iletim seviyesinde ve sinaptik de nöron duyarlılık düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.
Yeni araçlar, belirli bir promotör kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ederek beyin nöronlarının sayısız nöronlar belirlemenize yardımcı olmak için ortaya çıkmıştır. Hem mekansal ve zamansal olarak uyaran-indüklenen izlemek için Ca 2 GFP etiketli nöronlar, olmayan bir yeşil floresan Ca 2 + göstergesi boya n + yanıtlarıeeds kullanılır. Buna ek olarak, konfokal mikroskopi doku içindeki derinliği farklı düzlemlerde nöronlar görselleştirmek ve out-of-odak floresans sınırlamak için kabiliyeti nedeniyle doku dilimleri görüntüleme bireysel nöronların bir favori yöntemidir. Nöronlar 1 GFP-etiketli rasyometrik Ca 2 + gösterge fura-2 kombinasyon halinde kullanılmıştır. Ancak, boya ultraviyole (UV) ışık tarafından heyecanlı. UV ışık lazer ve sınırlı optik penetrasyon derinliği maliyeti birçok laboratuvarda kullanımı engellemiştir. Ayrıca, GFP floresan fura-2 sinyalleri 2 etkileyebilir. Bu nedenle, bir kırmızı floresan Ca 2 + gösterge boyası kullanmaya karar verdi. Fura-kırmızı büyük Strokes vites bir tek uyarılma dalgaboyu kullanılarak GFP ile kombinasyon halinde kırmızı renkli floresans analiz izin verir. Biz olfaktör nöronlar 3 GFP etiketli birlikte fura-kırmızı kullanarak önceden iyi sonuçlar vardı. Olfaktör doku dilimleri için protokoller e işe yaradıqually iyi hipotalamik nöronlar 4. Ca 2 tabanlı Fura-kırmızı + görüntüleme de başarıyla GFP etiketli pankreatik β-hücreleri ve HEK hücre 5,6 olarak ifade GFP etiketli reseptörleri ile kombine edildi. Fura-kırmızı küçük bir cilvesi göstergesi kalsiyum 7 bağlar kez 650 nm'de onun floresans yoğunluğunu azaltır olmasıdır. Bu nedenle, düşük Ca2 + konsantrasyon ile dinlenme nöronların floresan nispeten yüksek yoğunluğuna sahiptir. Unutulmamalıdır, diğer kırmızı Ca 2 +-göstergesi boyalar var veya şu anda geliştirilmekte olan, farklı nöron ve beyin bölgelerinde daha iyi ya da daha iyi sonuçlar verebilir.
Protocol
Discussion
Sinirbilim bir önemli soru beynin sosyal bilgiler nasıl işlediğini anlamak. Sosyal tanıma için gerekli bilgilerin bir baskın kaynağı koku veya pheromonal sinyalleri tarafından kodlanmıştır. Nöronal burun nüfus ve özellikle beyin, hipotalamus sinyallerin tanınması ile bu sinyallerin tespiti, birçok sosyal süreçler ve etki hormonlar ve diğer nöroendokrin faktörler 13-16 anahtar bir rol oynamaktadır. Birden çok fonksiyonlu nöronlar çekirdekler içeren hipotalamus gibi beyin bölgeleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz çalışmalarına katılan meslektaşlarımızın burada özetlenen ederim. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 'koku duyusunun Bütünleştirici analizi' dan hibe ve Volkswagen Vakfı (TLZ) tarafından desteklenmiştir. TLZ Volkswagen Vakfı Lichtenberg Profesörü.
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
References
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O’Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
- Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
- Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
- Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
- Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
- Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
- Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
- Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
- Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
- Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
- Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Properties of Asante Calcium Red – a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. , (2010).
