Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten
Summary
In diesem Protokoll, aktualisieren wir die jüngsten Fortschritte in der Bildgebung Ca<sup> 2 +</sup> Signale GFP-markierten Neuronen im Gehirn Gewebeschnitte mit einem rot fluoreszierenden Ca<sup> 2 +</sup> Indikatorfarbstoff.
Abstract
Trotz einer enormen Steigerung in unserem Wissen über die Mechanismen der Kodierung von Informationen im Gehirn, eine zentrale Frage, die die genauen molekularen Schritte sowie die Aktivität bestimmter Nervenzellen im multifunktionalen Kerne von Hirnarealen wie dem Hypothalamus bleiben. Dieses Problem umfasst die Identifizierung der molekularen Komponenten der Regulation verschiedener Neurohormon Signaltransduktionskaskaden beteiligt. Erhöhungen der intrazellulären Ca 2 + spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Empfindlichkeit von Nervenzellen, sowohl auf der Ebene der Signaltransduktion und an synaptischen Websites.
Neue Werkzeuge sind entstanden, um zur Ermittlung Neuronen in der Vielzahl von Neuronen des Gehirns durch Expression grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines bestimmten Promotors. Sowohl räumlich als auch zeitlich Stimulus-induzierten überwachen Ca 2 +-Antworten in GFP-markierten Neuronen, eine nicht-grünen fluoreszierenden Ca 2 +-Indikatorfarbstoff nEEDS verwendet werden. Darüber hinaus ist ein beliebtes Konfokalmikroskopie Verfahren zum Abbilden einzelner Neuronen in Gewebeschnitten durch seine Fähigkeit, Neuronen in verschiedenen Ebenen der Tiefe innerhalb des Gewebes sichtbar zu machen und außerhalb des Fokus Fluoreszenz begrenzen. Die ratiometrische Ca 2 +-Indikator Fura-2 wurde in Kombination mit Neuronen verwendet ein GFP-markierten. Jedoch wird der Farbstoff durch ultraviolettes (UV) Licht angeregt. Die Kosten für den Laser und die begrenzte optische Eindringtiefe des UV-Lichts verhindert die Verwendung in vielen Laboratorien. Darüber hinaus kann GFP-Fluoreszenz mit den Fura-2 Signale 2 stören. Deshalb haben wir beschlossen, ein rot fluoreszierendes Ca 2 +-Indikator-Farbstoff verwenden. Die riesige Strokes Verschiebung der Fura-Rot erlaubt multicolor Analyse der roten Fluoreszenz in Kombination mit GFP mit einer einzigen Anregungswellenlänge. Wir hatten zuvor gute Ergebnisse mit Fura-Rot in Kombination mit GFP-markierten olfaktorischen Neuronen 3. Die Protokolle für olfaktorischen Gewebeschnitten schien e arbeitenQually auch in Neuronen des Hypothalamus 4. Fura-rot Basis Ca 2 +-Imaging wurde auch erfolgreich mit GFP-markierten Pankreas β-Zellen und GFP-markierten Rezeptoren in HEK-Zellen 5,6 Ausdruck kombiniert. Ein wenig Laune des Fura-Rot ist, dass seine Fluoreszenzintensität bei 650 nm, wenn die Anzeige bindet Calcium 7 abnimmt. Daher weist die Fluoreszenz des ruhenden Neuronen mit niedrigen Ca 2 +-Konzentration relativ hoher Intensität. Es sollte angemerkt werden, dass andere rote Ca 2 +-Indikatorfarbstoffe existieren oder derzeit entwickelt werden, könnte das eine bessere oder verbesserte Ergebnisse in verschiedenen Neuronen und Hirnareale.
Protocol
Discussion
Eine wichtige Frage in den Neurowissenschaften ist es zu verstehen, wie das Gehirn soziale Informationen verarbeitet. Eine vorherrschende Quelle von Informationen, die für die gesellschaftliche Anerkennung wird durch Geruchs-oder Pheromone Signale kodiert. Der Nachweis dieser Signale durch neuronale Populationen in der Nase und der Erkennung der Signale im Gehirn, insbesondere der Hypothalamus, eine wichtige Rolle spielen in vielen sozialen Prozesse und Einfluss Hormone und andere neuroendokrine Faktoren 13-16.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken unseren Kollegen, die in der Arbeit beteiligt hier zusammengefasst. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 894), der DFG Schwerpunktprogramm 1392 "Integrative Analyse des Geruchssinns" und von der Volkswagen-Stiftung (TLZ) unterstützt. TLZ ist eine Lichtenberg Professor der Volkswagen-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
References
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