Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

A pesar de un aumento enorme en nuestro conocimiento sobre los mecanismos subyacentes a la codificación de la información en el cerebro, una cuestión fundamental en relación con los pasos precisos molecular, así como la actividad de neuronas específicas en multi-funcional núcleos de áreas del cerebro tales como el hipotálamo permanecer. Este problema se incluye la identificación de los componentes moleculares implicados en la regulación de diversas neurohormonas cascadas de transducción de señales. Las elevaciones de Ca ^{2 +} intracelular desempeñan un papel importante en la regulación de la sensibilidad de las neuronas, tanto en el nivel de transducción de señales y en los sitios sinápticos.

Han surgido nuevas herramientas para ayudar a identificar las neuronas en la miríada de neuronas cerebrales mediante la expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor particular. Para supervisar tanto espacial como temporalmente estímulo inducido por Ca ^{2 +} respuestas en GFP-etiquetados neuronas, un no-verde fluorescente Ca ^{2 +} colorante indicador nEEDS para ser utilizado. Además, la microscopía confocal es un método preferido de formación de imágenes de las neuronas individuales en rodajas de tejido debido a su capacidad para visualizar las neuronas en distintos planos de profundidad dentro del tejido y para limitar fuera de foco de fluorescencia. El ratiométrica Ca ^{2 +} indicador fura-2 se ha utilizado en combinación con GFP-etiquetados neuronas ^1. Sin embargo, el colorante es excitado por la luz ultravioleta (UV). El coste del láser y la limitada profundidad de penetración óptica de la luz UV impedido su uso en muchos laboratorios. Además, la fluorescencia de GFP puede interferir con las señales de fura-2 ^2. Por lo tanto, se decidió utilizar un color rojo fluorescente Ca ^{2 +} colorante indicador. El cambio Strokes enorme de fura-rojo multicolor permite el análisis de la fluorescencia de color rojo en combinación con GFP usando una longitud de onda de excitación única. Hemos tenido resultados buenos previamente utilizando fura-rojo en combinación con GFP-etiquetados neuronas olfativas ^3. Los protocolos para cortes de tejido olfativo parecía funcionar equally bien en las neuronas hipotalámicas ^4. Fura-red basada Ca ^{2 +} de imágenes también fue combinado con éxito con GFP-etiquetados β pancreáticas y células GFP-etiquetados receptores expresados ​​en células HEK ^5,6. Una peculiaridad de fura-red es que la intensidad de fluorescencia a 650 nm disminuye una vez que el indicador se une al calcio ^7. Por lo tanto, la fluorescencia de las neuronas en reposo con baja concentración de Ca ^{2 +} tiene una intensidad relativamente alta. Cabe señalar, que los otros rojos Ca ^{2 +-indicador} tintes existen o se están desarrollando, que podría dar mejores resultados o mejores en las neuronas y áreas diferentes del cerebro.