Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Nonostante un aumento enorme nella nostra conoscenza dei meccanismi alla base della codifica delle informazioni nel cervello, una questione centrale relativa alle tappe precise molecolari così come l'attività dei neuroni specifici nuclei multi-funzionale delle aree cerebrali come l'ipotalamo rimangono. Questo problema si include l'identificazione dei componenti molecolari coinvolti nella regolazione delle cascate di trasduzione del segnale diverse neuro ormone. Elevazioni di Ca ^{2 +} intracellulare svolgono un ruolo importante nella regolazione della sensibilità dei neuroni, sia a livello di trasduzione del segnale e nei siti sinaptici.

Sono emersi nuovi strumenti per identificare neuroni nel miriade di neuroni cerebrali esprimendo la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo di un promotore specifico. Per monitorare tempo e nello spazio stimolo-indotto di Ca ^{2 +} risposte in GFP-tagged neuroni, un non-verde fluorescente Ca ^{2 +} indicatore colorante nresponsabili politici da utilizzare. Inoltre, la microscopia confocale è un metodo preferito di neuroni immagini singole fette di tessuto a causa della sua capacità di visualizzare neuroni in diversi piani di profondità all'interno del tessuto e di limitare out-of-focus fluorescenza. Il raziometrico Ca ^{2 +} indicatore fura-2 è stato usato in combinazione con GFP-tagged neuroni ^1. Tuttavia, il colorante viene eccitato da raggi ultravioletti (UV). Il costo del laser e la limitata profondità di penetrazione della luce UV ottico ostacolato il suo uso in molti laboratori. Inoltre, fluorescenza GFP può interferire con le fura-2 segnali ^2. Pertanto, abbiamo deciso di utilizzare un rosso fluorescente Ca ^{2 +} indicatore colorante. L'enorme cambiamento Strokes di fura-rosso permette analisi multicolore della fluorescenza rossa in combinazione con GFP usando una singola lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo avuto buoni risultati precedentemente con fura-rosso, in combinazione con GFP-tagged neuroni olfattivi ^3. I protocolli di fettine di tessuto olfattivi sembrava funzionare equally bene in neuroni ipotalamici ^4. Fura-rosso sulla base di Ca ^{2 +} di imaging è successo anche in combinazione con GFP-tagged pancreatiche β-cellule e GFP-tagged recettori espressi in cellule HEK ^5,6. Una peculiarità del piccolo fura-red è che la sua intensità di fluorescenza a 650 nm diminuisce per l'indicatore si lega calcio ^7. Pertanto, la fluorescenza di neuroni di sosta con bassa concentrazione di Ca ^{2 +} ha intensità relativamente elevata. Va notato, che gli altri rossi Ca ^{2 +} indicatori di coloranti esistono o sono in fase di sviluppo, che potrebbe dare risultati migliori o migliorate di neuroni e aree cerebrali.