Respostas de imagem de cálcio nos neurônios GFP-tagged fatias de cérebro de rato Hipotalâmicos

Apesar de um aumento enorme no nosso conhecimento sobre os mecanismos subjacentes a codificação de informação no cérebro, a questão central sobre os passos precisos moleculares, bem como a actividade de neurónios específicos em multi-funcional núcleos de áreas cerebrais, tais como o hipotálamo permanecem. Este problema abrange a identificação dos componentes moleculares envolvidos na regulação de vários neuro-hormonais cascatas de transdução de sinal. Elevações de Ca ^{2 +} intracelular desempenham um papel importante na regulação da sensibilidade de neurónios, quer ao nível de transdução de sinal e em locais sinápticos.

Novas ferramentas surgiram para ajudar a identificar os neurónios a miríade de neurónios do cérebro por expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo de um promotor particular. Para monitorar tanto espacialmente e temporalmente estímulo induzido Ca ^{2 +} respostas em GFP-tagged neurônios, um não-verde fluorescente Ca ^{2 +} indicador corante needs a ser utilizado. Além disso, a microscopia confocal é um método preferido de neurónios individuais de imagem em fatias de tecido devido à sua capacidade de visualizar os neurónios em planos distintos de profundidade dentro do tecido e para limitar fora de foco fluorescente. O Ca ^{2 +} raciométrica indicador fura-2 tem sido utilizado em combinação com GFP-tagged neurônios ^1. No entanto, o corante é excitada por luz ultravioleta (UV). O custo do laser e a profundidade de penetração limitada óptico da luz UV pode prejudicar a sua utilização em muitos laboratórios. Além disso, a GFP fluorescente pode interferir com os sinais de ^fura-2 2. Por isso, decidimos usar um vermelho fluorescente Ca ^{2 +} corante indicador. A mudança Strokes enorme de fura-vermelho permite multicolor análise da fluorescência vermelha em combinação com GFP utilizando um comprimento de onda de excitação único. Tivemos bons resultados anteriormente usando fura-vermelho em combinação com GFP-tagged neurônios olfativos ^3. Os protocolos para os cortes de tecidos olfactivos parecia estar a trabalhar eQually bem em neurônios do hipotálamo ^4. Fura-vermelho base de Ca ^{2 +} da imagem foram também combinados com sucesso com GFP-tagged β pancreáticas e células GFP-tagged receptores expressos em células HEK ^5,6. Uma peculiaridade pouco de fura-vermelho é que a sua intensidade de fluorescência a 650 nm diminui uma vez que o indicador se liga de cálcio ^7. Assim, a fluorescência de neurónios de repouso com baixa concentração de Ca ^{+ 2} tem intensidade relativamente alta. Note-se, que os outros vermelhos Ca ^{2 +} indicadoras de corantes existem ou estão sendo desenvolvidos atualmente, que poderia dar melhores resultados ou melhores em neurônios e áreas diferentes do cérebro.