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Neuroscience

Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

Published: October 13, 2012
doi:
10.3791/4193
, ,
1Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering,University of Toronto, 2Lyndhurst Centre,Toronto Rehabilitation Institute, 3Department of Surgery,University of Toronto

Summary

En este protocolo, se muestran cómo construir cámaras personalizados que permitan la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa para activar el tiempo de imágenes a intervalos de cerebro adulto derivado translocación célula precursora neural durante galvanotaxia.

Abstract

El descubrimiento de células madre neurales y células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurales) (CPN) en el cerebro adulto de mamíferos ha conducido a un cuerpo de la investigación dirigida a la utilización de las propiedades multipotentes y proliferativa de estas células para el desarrollo de estrategias neuroregenerativas. Un paso crítico para el éxito de tales estrategias es la movilización de NPCs hacia un sitio de la lesión después de un trasplante exógeno o para aumentar la respuesta de los precursores endógenos que se encuentran en la región periventricular del SNC. Por consiguiente, es esencial para comprender los mecanismos que promueven, orientar y mejorar la migración NPC. Nuestro trabajo se centra en la utilización de los campos eléctricos de corriente directa (dcEFs) promover y migración NPC directa – un fenómeno conocido como galvanotaxia. Endógenos campos eléctricos funcionan como señales fisiológicas esenciales para la migración celular durante el desarrollo normal y la reparación de heridas. Interrupción farmacológica de latrans-neural en embriones de potencial tubo axolotl provoca graves malformaciones en el desarrollo 1. En el contexto de la cicatrización de heridas, la tasa de reparación de córnea heridos se correlaciona directamente con la magnitud del potencial de heridas epiteliales que surge después de la lesión, como se muestra por la mejora farmacológica o la interrupción de este dcEF 2-3. Hemos demostrado que los adultos NPCs subependimales someterse a migración catódica rápida y dirigida in vitro cuando se exponen a un dcEF aplicada externamente. En este protocolo se describen técnicas de nuestro laboratorio para la creación de un ensayo de galvanotaxia simple y eficaz para la alta resolución, observación a largo plazo de la translocación dirigida cuerpo celular (migración) en un nivel de una sola célula. Este ensayo sería adecuado para la investigación de los mecanismos que regulan la transducción de dcEF en la motilidad celular mediante el uso de ratones transgénicos o knockout, ARN corto de interferencia, o agonistas / antagonistas de receptores específicos.

Protocol

Todos los procedimientos que impliquen la manipulación de animales fueron aprobados por la Universidad de Toronto Comité de Cuidado de Animales de acuerdo con las directrices institucionales (Protocolo n º. 20009387). Los siguientes métodos se debe realizar utilizando instrumentos estériles y técnicas, en una campana de flujo laminar en su caso. En el texto siguiente protocolo, la frase "EFH-SFM" se refiere a medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidér…

Representative Results

Análisis cinemático revela que en presencia de un 250 mV / mm dcEF, NPCs indiferenciadas exponer galvanotaxia altamente dirigidos y rápido hacia el cátodo (Figura 5A, Película 1). En ausencia de un dcEF, movimiento al azar de las células se observó (Figura 5B, Película 2). En esta intensidad de campo,> 98% de NPCs indiferenciadas migrar para toda 6-8 hr para los que se explora, y ya que las células muertas no migran esto sugiere que permanecen viables durante este período e…

Discussion

Este protocolo ha sido adaptado de los métodos bien establecidos de estudios previos 7-9. Galvanotactic cámaras pueden construirse utilizando una variedad de técnicas diferentes, incluyendo la construcción de un vaso separado bien para el confinamiento de la siembra de células, o el uso de CO 2 ablación con láser para la microfabricación de la depresión central 10,11. Algunas técnicas pueden ser más laborioso o costosos que otros. Se ha descrito un ensayo simple y rentable par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es financiado por las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (subvención # 249669, 482986 y #) y Heart and Stroke Foundation de Canadá (subvención # 485508). Los autores agradecen a Youssef El-Hayek y el Dr. Qi Wan por su ayuda en la elaboración de los protocolos experimentales.

Materials

Name of item Company Catalogue number Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl Sigma S5886 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl Sigma P5405 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3 Sigma S5761 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose Sigma G6152 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2 Sigma C7902 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin Gibco 15070
Bovine pancreas trypsin Sigma T1005
Sheep testes hyaluronidase Sigma H6254
Kynurenic acid Sigma K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor Worthington LS003086
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 21700075
30% Glucose Sigma G6152
7.5% NaHCO3 Sigma S5761
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine Gibco 25030
EGF Invitrogen PMG8041 Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF Invitrogen PHG0226 Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin Sigma H3149
Apo-transferrin R&D Systems 3188-AT 0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine Sigma P7505 Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin Sigma I5500 Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides VWR 16004
6N Hydrochloric Acid VWR BDH3204-1
High vacuum grease Dow Corning
60 mm Petri dishes Fisher Scientific 0875713A
Poly-L-lysine Sigma P4707
Matrigel BD Biosciences 354234 Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS Invitrogen 10082139 Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope Olympus CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire Alfa Aesar 11434
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Heat Inactivated FBS Sigma 16140071
PVC tubing Fisher Scientific 80000006 3/32″ID x 5/32″OD
Bleach Clorox
10 cc syringe BD 309604
18 gauge needle BD 305195
Dremel drill Dremel Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber Zeiss Axiovert-200M

Recipes

Item Volume
2M NaCl 6.2 ml
1M KCl 0.5 ml
1M MgCl2 0.32 ml
155mM NaHCO3 16.9 ml
1M Glucose 1 ml
108 mM CaCl2 0.09256 ml
Penicillin-streptomycin 1 ml
Autoclaved water 74 ml

Artificial cerebrospinal fluid

Item Volume or Mass
Artificial cerebrospinal fluid 30 ml
Bovine pancreas trypsin 40 mg
Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg
Kynurenic acid 5 mg

Trypsin Solution

Item Volume or Mass
SFM 15 ml
Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg

Trypsin Inhibitor Solution

Item Volume
Autoclaved water 37 ml
10X DMEM/F12 10 ml
30% Glucose 2 ml
7.5% NaHCO3 1.5 ml
1M HEPES 0.5 ml
Transferrin, Putrescine solution 4 ml
25 mg insulin solution 4 ml
Selenium 100 μl
Progesterone 100 μl

Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)

Item Volume
Autoclaved water 37.5 ml
10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml
30% Glucose 1 ml
7.5% NaHCO3 0.75 ml
1M HEPES 0.25 ml
Hormone mix 5 ml
L-glutamine 0.5 ml
Penicillin-streptomycin 0.5 ml

Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS

Item Volume
Matrigel 150 μl
SFM 3.6 ml

Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.

Item Volume or Mass
UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20
SFM
Heat Inactivated FBS		 8 ml
2 ml

Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.
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References

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Galvanotaxis AssayNeural Precursor Cell MigrationExternally Applied Direct Current Electric FieldNeural Stem CellsNeuroregenerative StrategiesMobilization Of NPCsLesion SiteEndogenous PrecursorsPeriventricular RegionMechanisms Of NPC MigrationDirect Current Electric Fields (dcEFs)Galvanotaxis PhenomenonPhysiological Electric FieldsCell MigrationNormal DevelopmentWound Repair

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Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field. J. Vis. Exp. (68), e4193, doi:10.3791/4193 (2012).
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