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Neuroscience

Un test Galvanotaxis Analisi della Cinetica precursori neurali migrazione cellulare in un campo applicato esternamente diretto Corrente elettrica

Published: October 13, 2012
doi:
10.3791/4193
, ,
1Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering,University of Toronto, 2Lyndhurst Centre,Toronto Rehabilitation Institute, 3Department of Surgery,University of Toronto

Summary

In questo protocollo si dimostra come costruire camere personalizzate che consentono l'applicazione di un campo di corrente elettrica diretta a consentire time-lapse imaging del cervello adulto derivato neurale traslocazione cellula precursore durante galvanotaxis.

Abstract

La scoperta di staminali e cellule progenitrici (collettivamente chiamati cellule precursori neurali) (NPC) nel cervello dei mammiferi adulti ha portato ad un corpo di ricerca finalizzata ad utilizzare le proprietà multipotenti e proliferativi di queste cellule per lo sviluppo di strategie neurorigenerativo. Un punto critico per il successo di tali strategie è la mobilitazione di NPC verso un sito di lesione dopo trapianto esogena o per migliorare la risposta dei precursori endogeni che si trovano nella regione periventricolare del SNC. Di conseguenza, è essenziale per comprendere i meccanismi che promuovono, guidare, e migliorare la migrazione NPC. Il nostro lavoro si concentra su l'utilizzo di campi elettrici a corrente diretta (dcEFs) per la promozione e la migrazione diretta NPC – un fenomeno noto come galvanotaxis. Campi elettrici endogeni fisiologici operato come spunti critici per la migrazione delle cellule durante il normale sviluppo e la riparazione delle ferite. Interruzione farmacologica dellatrans-neurale potenziale tubo in embrioni axolotl causa gravi malformazioni dello sviluppo 1. Nel contesto della guarigione delle ferite, il tasso di riparazione di cornea feriti è direttamente correlata con la grandezza del potenziale lesione epiteliale che sorge dopo la lesione, come mostrato dal miglioramento farmacologico o interruzione di questo dcEF 2-3. Abbiamo dimostrato che adulti NPC subependimali incontro a rapida e diretta migrazione catodiche in vitro quando esposti ad un dcEF applicata esternamente. In questo protocollo si descrivono le tecniche del nostro laboratorio per la creazione di un saggio galvanotaxis semplice ed efficace ad alta risoluzione, osservazione a lungo termine della traslocazione cellula diretto del corpo (migrazione) su una singola cellula. Questo saggio sarebbe adatto per indagare i meccanismi che regolano la trasduzione dcEF in motilità cellulare attraverso l'uso di topi transgenici o knockout, brevi RNA interferenti, o agonisti dei recettori specifici / antagonisti.

Protocol

Tutte le procedure che comportano il trattamento degli animali sono state approvate dal Comitato Università di Toronto Animal Care in conformità con le linee guida istituzionali (protocollo n. 20009387). I metodi seguenti devono essere effettuate utilizzando strumenti sterili e tecniche, in una cappa a flusso laminare dove applicabile. Nel testo del protocollo sottostante, la frase "EFH-SFM" si riferisce a mezzi di informazione liberi siero integrato con il fattore di crescita ep…

Representative Results

Analisi cinematica rivela che in presenza di un mV / mm 250 dcEF, NPCs indifferenziate esporre galvanotaxis altamente orientati e rapido verso il catodo (figura 5A, Movie 1). In assenza di un dcEF, movimento casuale delle cellule si osserva (figura 5B, Movie 2). A questa forza di campo,> 98% di NPCs indifferenziate migrare per l'intero 6-8 hr per cui essi vengono esposte, e poiché le cellule morte non migrano questo suggerisce che essi rimangono vitali durante questo periodo, in…

Discussion

Questo protocollo è stato adattato da ben consolidati metodi di studi precedenti 7-9. Camere Galvanotactic può essere costruito utilizzando una varietà di tecniche diverse, compresa la costruzione di un bicchiere ben separata per il confinamento di semina cellulare, o mediante ablazione laser CO 2 per microfabbricazione del trogolo centrale 10,11. Alcune tecniche possono essere più laborioso o costose di altre. Abbiamo descritto un test semplice e conveniente per la costruzione di un…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è finanziato dalla scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (sovvenzione # 249669, # 482986 e) e Heart and Stroke Foundation of Canada (sovvenzione # 485508). Gli autori ringraziano Youssef El-Hayek e il dottor Qi Wan per la loro assistenza nello sviluppo dei protocolli sperimentali.

Materials

Name of item Company Catalogue number Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl Sigma S5886 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl Sigma P5405 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3 Sigma S5761 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose Sigma G6152 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2 Sigma C7902 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin Gibco 15070
Bovine pancreas trypsin Sigma T1005
Sheep testes hyaluronidase Sigma H6254
Kynurenic acid Sigma K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor Worthington LS003086
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 21700075
30% Glucose Sigma G6152
7.5% NaHCO3 Sigma S5761
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine Gibco 25030
EGF Invitrogen PMG8041 Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF Invitrogen PHG0226 Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin Sigma H3149
Apo-transferrin R&D Systems 3188-AT 0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine Sigma P7505 Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin Sigma I5500 Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides VWR 16004
6N Hydrochloric Acid VWR BDH3204-1
High vacuum grease Dow Corning
60 mm Petri dishes Fisher Scientific 0875713A
Poly-L-lysine Sigma P4707
Matrigel BD Biosciences 354234 Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS Invitrogen 10082139 Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope Olympus CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire Alfa Aesar 11434
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Heat Inactivated FBS Sigma 16140071
PVC tubing Fisher Scientific 80000006 3/32″ID x 5/32″OD
Bleach Clorox
10 cc syringe BD 309604
18 gauge needle BD 305195
Dremel drill Dremel Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber Zeiss Axiovert-200M

Recipes

Item Volume
2M NaCl 6.2 ml
1M KCl 0.5 ml
1M MgCl2 0.32 ml
155mM NaHCO3 16.9 ml
1M Glucose 1 ml
108 mM CaCl2 0.09256 ml
Penicillin-streptomycin 1 ml
Autoclaved water 74 ml

Artificial cerebrospinal fluid

Item Volume or Mass
Artificial cerebrospinal fluid 30 ml
Bovine pancreas trypsin 40 mg
Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg
Kynurenic acid 5 mg

Trypsin Solution

Item Volume or Mass
SFM 15 ml
Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg

Trypsin Inhibitor Solution

Item Volume
Autoclaved water 37 ml
10X DMEM/F12 10 ml
30% Glucose 2 ml
7.5% NaHCO3 1.5 ml
1M HEPES 0.5 ml
Transferrin, Putrescine solution 4 ml
25 mg insulin solution 4 ml
Selenium 100 μl
Progesterone 100 μl

Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)

Item Volume
Autoclaved water 37.5 ml
10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml
30% Glucose 1 ml
7.5% NaHCO3 0.75 ml
1M HEPES 0.25 ml
Hormone mix 5 ml
L-glutamine 0.5 ml
Penicillin-streptomycin 0.5 ml

Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS

Item Volume
Matrigel 150 μl
SFM 3.6 ml

Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.

Item Volume or Mass
UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20
SFM
Heat Inactivated FBS		 8 ml
2 ml

Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.
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References

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Galvanotaxis AssayNeural Precursor Cell MigrationExternally Applied Direct Current Electric FieldNeural Stem CellsNeuroregenerative StrategiesMobilization Of NPCsLesion SiteEndogenous PrecursorsPeriventricular RegionMechanisms Of NPC MigrationDirect Current Electric Fields (dcEFs)Galvanotaxis PhenomenonPhysiological Electric FieldsCell MigrationNormal DevelopmentWound Repair

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Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field. J. Vis. Exp. (68), e4193, doi:10.3791/4193 (2012).
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