Assay Galvanotaxis לניתוח של קינטיקס נדידת תאים העצביים המבשר בשדה חשמלי נוכחי לשימוש חיצוני ישיר
Summary
בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לבנות תאים מותאמים אישית המאפשרים יישום של שדה חשמלי בזרם ישר כדי לאפשר הדמית זמן לשגות של המוח מבוגר נגזר טרנסלוקציה תא מבשר העצבית במהלך galvanotaxis.
Abstract
הגילוי של גזע עצבי ותאי אב (תאים מבשרים עצביים המכונים באופן קולקטיבי) (NPCs) במוח של יונקי הבוגרים הוביל לגופו של מחקר שהמטרה תוך ניצול תכונות multipotent ושגשוג של תאים אלו לפיתוח אסטרטגיות neuroregenerative. צעד קריטי להצלחה של אסטרטגיות כאלו היא התגייסות NPCs לכיוון אתר נגע לאחר השתלת אקסוגני או כדי לשפר את התגובה של מבשרי אנדוגני הנמצאים באזור periventricular של מערכת העצבים המרכזיים. בהתאם לכך, הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים שמקדמים, להדריך, ולשפר את הגירת NPC. העבודה שלנו מתמקדת בניצול של שדות חשמליים של זרם ישירים (dcEFs) לקידום והגירת NPC ישירה – תופעה הידועה בgalvanotaxis. שדות חשמליים פיסיולוגיים אנדוגניים לתפקד כרמזים קריטיים לנדידת תאים במהלך התפתחות תקינה ותיקון פצע. שיבוש תרופתיפוטנציאל צינור טרנס עצבי בעוברי האמביסטומה גורם מומים התפתחותיים חמורים 1. בהקשר של ריפוי פצע, קצב התיקון של קרנית פגועה מתואם ישירות עם סדר הגודל של פוטנציאל פצע אפיתל שמתעורר לאחר פציעה, כפי שמוצג על ידי שיפור או שיבוש תרופתי של 2-3 dcEF זה. אנחנו הוכחנו כי NPCs subependymal המבוגר לעבור הגירת cathodal מהירה וביים במבחנה, כאשר נחשף לdcEF לשימוש חיצוני. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות של המעבדה שלנו ליצירת assay galvanotaxis פשוט ויעיל לרזולוציה גבוהה, תצפית ארוכת הטווח של טרנסלוקציה ביימה תא בגוף (נדידה) ברמת תא בודד. assay זה יהיה מתאים לחוקר את המנגנונים המווסתים את תמרת dcEF לתנועתיות סלולרית באמצעות השימוש בעכברים מהונדסים או נוקאאוט, RNA התערבות הקצר, או אגוניסטים הקולטן ספציפיים / יריבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה הותאם מהשיטות המבוססות היטב של מחקרים קודמים 7-9. תאי Galvanotactic ניתן לבנות תוך שימוש במגוון טכניקות שונות, כולל הבנייה של זכוכית נפרדת גם לכליאה של זריעת תא, או באמצעות אבלציה הליזר CO 2 לmicrofabrication של השוקת המרכזית 10,11. טכניקות מסוימות עשויות ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (מענק # 249669, ו# 482986) ולב ושבץ קרן של קנדה (מענק # 485508). המחברים מודים יוסוף אל האייק וואן ד"ר צ'י על סיועם בפיתוח פרוטוקולי הניסוי.
Materials
| Name of item | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32″ID x 5/32″OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
References
- Borgens, R. B., Shi, R. Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential. Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).
- Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo. Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).
- Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics. J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).
- Erickson, C. A., Nuccitelli, R. Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields. J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).
- Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).
- Li, L. Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration. Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).
- Song, B. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
- Huang, C. -. W., Cheng, J. -. Y., Yen, M. -. H., Young, T. -. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
- SATO, M. Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells. Biosystems. 88, 261-272 (2007).
- Meng, X. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).
- Zhao, M. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. The FASEB Journal. , (2002).
- Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).
- McCaig, C. D. Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential. Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).
- Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat. Med. 8, 268-273 (2002).
- Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields. PLoS ONE. 6, e23808 (2011).
- Deuschl, G. A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson’s Disease. N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).
- Stone, S. S. D. Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory. J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).
