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Neuroscience

A Galvanotaxis Assay für die Analyse von neuralen Vorläuferzellen Cell Migration Kinetics in einem von außen angelegten Direct Current Electric Field

Published: October 13, 2012
doi:
10.3791/4193
, ,
1Institute for Biomaterials and Biomedical Engineering,University of Toronto, 2Lyndhurst Centre,Toronto Rehabilitation Institute, 3Department of Surgery,University of Toronto

Summary

In diesem Protokoll zeigen wir, wie Sie benutzerdefinierte Kammern, die die Anwendung eines Gleichstrom elektrisches Feld an Zeitraffer-Aufnahmen von erwachsenen Gehirn abgeleitete neurale Vorläuferzellen Translokation während Galvanotaxis ermöglichen ermöglichen konstruieren.

Abstract

Die Entdeckung von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (kollektiv als neuralen Vorläuferzellen) (NPC) im erwachsenen Gehirn von Säugetieren ist an einem Körper der Forschung auf die Nutzung der multipotenten und proliferativen Eigenschaften dieser Zellen für die Entwicklung von Strategien neuroregenerative gerichtet geführt. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg einer solchen Strategie ist die Mobilisierung von NSC Richtung einer Läsionsstelle nach Transplantation oder exogene, um die Reaktion der endogenen Vorstufen, die in der periventrikulären Region des ZNS gefunden werden verbessern. Dementsprechend ist es wichtig, die Mechanismen, die zu fördern leiten, und verbessern NPC Migration verstehen. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Nutzung von Gleichstrom elektrische Felder (dcEFs) zu fördern und zu direkten NPC Migration – ein Phänomen, das als Galvanotaxis bekannt. Endogenen physiologischen elektrischen Feldern funktionieren als kritische Hinweise für die Zellwanderung während der normalen Entwicklung und Wundheilung. Pharmakologische Unterbrechung dertrans-Neuralrohr Potenzial Axolotl Embryonen verursacht schweren Entwicklungsstörungen Fehlbildungen 1. Im Rahmen der Wundheilung, wird die Rate der Reparatur der verwundeten Hornhaut direkt mit der Größe der Wunde epithelialen Potential, das nach der Verletzung auftritt korreliert, als durch pharmakologische Verstärkung oder Störung dieses dcEF 2-3 gezeigt. Wir haben gezeigt, dass adulte subependymale NPCs rasche und gerichteten Migration kathodenseitigen in vitro durchlaufen, wenn sie einem von außen angelegten dcEF ausgesetzt. In diesem Protokoll beschreiben wir unser Labor die Techniken für die Schaffung eines einfachen und effektiven Galvanotaxis Assay für hochauflösende, langfristige Beobachtung der Regie Zellkörper Translokation (Migration) auf einer Ebene einzelner Zellen. Dieser Assay wäre geeignet für die Untersuchung der Mechanismen, dcEF Transduktion in zelluläre Motilität regulieren durch die Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäuse, short interfering RNA oder spezifischen Rezeptor Agonisten / Antagonisten.

Protocol

Alle Verfahren, die Behandlung der Tiere wurden von der University of Toronto Animal Care Committee in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts (Protokoll Nr. 20.009.387) zugelassen. Die folgenden Methoden sollten unter Verwendung steriler Instrumente und Techniken in einer Sterilbank, soweit zutreffend. Im Protokoll-Text bezieht sich der Ausdruck "EFH-SFM" zu serumfreiem Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Heparin ergänzt. …

Representative Results

Kinematische Analyse zeigt, daß in Gegenwart von 250 mV / mm dcEF, undifferenzierte NPCs sehr gerichtet und rasche Galvanotaxis Richtung der Kathode (5A, Kinofilm 1) aufweisen. In Abwesenheit eines dcEF wird zufällige Bewegung der Zellen beobachtet (5B, Film 2). Zu dieser Feldstärke> 98% von undifferenzierten NSCs für die gesamte 6-8 h, für die sie abgebildet migrieren, und da tote Zellen nicht migrieren dies legt nahe, dass sie lebensfähig bleiben während dieses Zeitraums in …

Discussion

Dieses Protokoll wurde von den etablierten Methoden der früheren Studien 7-9 angepasst. Galvanotactic Kammern kann unter Verwendung einer Vielzahl von verschiedenen Techniken, einschließlich der Errichtung eines separaten Glas gut für Einschluss Zellaussaat oder mit Hilfe von CO 2-Laser-Ablation zur Mikrofabrikation des zentralen Rinne 10,11 werden. Einige Techniken können mehr mühsam oder kostspieliger als andere. Wir haben eine einfache und kostengünstige Konstruktion eines Assay…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant # 249669 und # 482986) und Heart and Stroke Foundation of Canada (Grant # 485508) gefördert. Die Autoren danken Youssef El-Hayek und Dr. Qi Wan für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der experimentellen Protokolle.

Materials

Name of item Company Catalogue number Comments
Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl Sigma S5886 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl Sigma P5405 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2 Sigma M2393 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3 Sigma S5761 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose Sigma G6152 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2 Sigma C7902 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin Gibco 15070
Bovine pancreas trypsin Sigma T1005
Sheep testes hyaluronidase Sigma H6254
Kynurenic acid Sigma K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor Worthington LS003086
DMEM Invitrogen 12100046
F12 Invitrogen 21700075
30% Glucose Sigma G6152
7.5% NaHCO3 Sigma S5761
1M HEPES Sigma H3375 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine Gibco 25030
EGF Invitrogen PMG8041 Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF Invitrogen PHG0226 Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin Sigma H3149
Apo-transferrin R&D Systems 3188-AT 0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine Sigma P7505 Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin Sigma I5500 Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium Sigma S9133
Progesterone Sigma P6149
Standard Dissection Tools Fine Science Tools
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000
Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides VWR 16004
6N Hydrochloric Acid VWR BDH3204-1
High vacuum grease Dow Corning
60 mm Petri dishes Fisher Scientific 0875713A
Poly-L-lysine Sigma P4707
Matrigel BD Biosciences 354234 Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS Invitrogen 10082139 Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope Olympus CKX41
Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire Alfa Aesar 11434
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Heat Inactivated FBS Sigma 16140071
PVC tubing Fisher Scientific 80000006 3/32″ID x 5/32″OD
Bleach Clorox
10 cc syringe BD 309604
18 gauge needle BD 305195
Dremel drill Dremel Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber Zeiss Axiovert-200M

Recipes

Item Volume
2M NaCl 6.2 ml
1M KCl 0.5 ml
1M MgCl2 0.32 ml
155mM NaHCO3 16.9 ml
1M Glucose 1 ml
108 mM CaCl2 0.09256 ml
Penicillin-streptomycin 1 ml
Autoclaved water 74 ml

Artificial cerebrospinal fluid

Item Volume or Mass
Artificial cerebrospinal fluid 30 ml
Bovine pancreas trypsin 40 mg
Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg
Kynurenic acid 5 mg

Trypsin Solution

Item Volume or Mass
SFM 15 ml
Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg

Trypsin Inhibitor Solution

Item Volume
Autoclaved water 37 ml
10X DMEM/F12 10 ml
30% Glucose 2 ml
7.5% NaHCO3 1.5 ml
1M HEPES 0.5 ml
Transferrin, Putrescine solution 4 ml
25 mg insulin solution 4 ml
Selenium 100 μl
Progesterone 100 μl

Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)

Item Volume
Autoclaved water 37.5 ml
10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml
30% Glucose 1 ml
7.5% NaHCO3 0.75 ml
1M HEPES 0.25 ml
Hormone mix 5 ml
L-glutamine 0.5 ml
Penicillin-streptomycin 0.5 ml

Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS

Item Volume
Matrigel 150 μl
SFM 3.6 ml

Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.

Item Volume or Mass
UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20
SFM
Heat Inactivated FBS		 8 ml
2 ml

Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.
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References

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Galvanotaxis AssayNeural Precursor Cell MigrationExternally Applied Direct Current Electric FieldNeural Stem CellsNeuroregenerative StrategiesMobilization Of NPCsLesion SiteEndogenous PrecursorsPeriventricular RegionMechanisms Of NPC MigrationDirect Current Electric Fields (dcEFs)Galvanotaxis PhenomenonPhysiological Electric FieldsCell MigrationNormal DevelopmentWound Repair

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Babona-Pilipos, R., Popovic, M. R., Morshead, C. M. A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field. J. Vis. Exp. (68), e4193, doi:10.3791/4193 (2012).
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