本文详细介绍了协议,在宫内electroporate大脑皮层和海马小鼠E14.5。我们还表明,这是一个有价值的方法来研究在这两个脑区的树突和刺。
(IUE)为何在子宫内电已成为一个强大的技术来研究胚胎神经系统1-5不同地区的发展。迄今为止,这个工具已经被广泛用于研究调控细胞增殖,分化和神经细胞迁移,尤其是在发展中国家大脑皮层6-8。这里我们详细协议electroporate在子宫内的大脑皮质和海马和提供的证据表明,这种方法可以用来研究这两个脑区的树突和棘。
在原代培养神经元的可视化和操纵,有助于更好地理解到参与在树突棘和突触发展的进程。然而神经细胞在体外生长,没有接触到所有的生理线索,期间可能会影响正常发育枝和/或脊柱的形成和维护。我们的知识枝和脊柱结构<e米在野生型或突变小鼠体内>,大多是从观测使用的高尔基考克斯方法9。然而,高尔基染色被认为是不可预测的。事实上,神经细胞和神经纤维束组随机标记,与特定领域经常出现的完全染色,而相邻的地区是没有染色。最近的研究表明,荧光结构IUE位置代表一个有吸引力的替代方法研究10-11( 图1A)突变型/野生型小鼠树突棘,以及作为突触。此外,相比一代鼠标击倒,IUE位置代表一个快速的方法进行细胞的特定人群在特定时间窗口增益和丧失功能的研究。此外,IUE位置已被成功地用于诱导基因表达或诱导的RNAi方法提炼的时间控制在表达一个基因或shRNA 12。 ,IUE这些优势,从而opened个新的尺寸,研究基因表达/抑制不仅在特定的脑结构( 图1B),但还处于发展的特定时间点( 图1C)对树突棘的影响。
最后,IUE位置提供了一个有用的工具,以确定枝,脊椎和/或突触发育有关的基因之间的功能互动。事实上,在其他如病毒基因转移方法相比,它是直接结合多个RNA干扰或转基因细胞的相同人口。
总之,IUE位置是一个功能强大的方法,已经促成表征的脑功能和疾病背后的分子机制,也应该在树突棘的研究有用。
IUE位置是一个功能强大的工具来操纵基因的表达,不仅在空间上,而且在时间。在这里,我们表明,这种技术可以用于可视化和基因操纵树突棘在小鼠大脑皮层和海马。除了前面提到的优点,值得一提的是,IUE位置,在高尔基方法的对比,可以用免疫组化或原位杂交,例如电穿孔细胞型允许结合。同样重要的是提到,此过程不会引起明显脑畸形,尽管它相对的侵袭。此外,在细胞水平上,IUE位置不修改13神经元的电穿孔的电生理特性。虽然我们的枝和脊椎形态的可视化示范重点,在E14.5皮质或海马神经元IUE位置也用于研究其他发展活动,如轴突的形成和指导。在添加ition,同一种协议,可以实现在胚胎发育的其他阶段,针对不同的人群。例如,在E18.5发育很晚皮质电范式可以驾驶1星形细胞祖细胞中的表达。同样,而在E14.5海马电允许同时针对海马CA1-CA3区锥体神经元祖细胞和齿状回颗粒细胞祖,后期海马电(E18.5或产后早期)将允许针对不同的齿状回祖14。在这种情况下,DNA的注射量可以增加以及电流强度。
IUE位置由引进的转基因似乎仍然附加体式,并因此失去了连续的细胞分裂后的细胞。然而,在分裂后的细胞,如神经元,附加体式转基因保持活跃后电击使长期研究13个月15。在我们的研究中,我们已经观察到明亮的绿色荧光蛋白+细胞7周后出生(我们分析了最新的时间点),表明胚胎针对使用IUE位置从早期发育时间点的结果,在转基因持续表达的皮质或海马神经元前体到成年。
目前的技术限制,这是很难施加罚款的电穿孔细胞总数控制。然而,我们的DNA溶液注入量减少,表明它是可能标注少数细胞和树突状树枝状可视化的孤立的GFP +细胞以及他们的刺。转染面积的尺寸,也可以通过修改如电流和脉冲数或电桨直径强度的电参数调整。
共有IUE位置是很容易实现,快速的方法,高效和体内研究树突棘。
The authors have nothing to disclose.
笔者想感谢他们的帮助凯瑟琳·马瑟斯博士,博士让-菲利普·Mocho和约兰达·萨维德拉托雷斯博士在宫内电执行无菌程序下,海莉木对她的帮助下准备的图纸。
支持的EP是由长期的欧洲生化学会联合会(FEBS)奖学金和医学研究理事会(MRC)的职业发展奖学金,MAH的威康信托基金赠款到伊丽莎白费舍尔和维克多Tybulewicz(080174/B/06/Z) ,硬件由欧洲分子生物学长短期奖学金和RA MRC的助学金。这项工作得到了从威康信托基金会(086947/Z/08/Z)项目赠款,由格兰特在急救医学研究理事会(U117570528)福源
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |