Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em> In utero</em> Elektroporatie

In het Verenigd Koninkrijk, worden muizen gehuisvest, gefokt, en behandeld volgens de richtlijnen goedgekeurd door het ministerie van Binnenlandse Zaken onder het dier (Scientific Procedures) Act 1986. 1. Voorbereiding: DNA-oplossing en naalden Zuiver plasmide DNA met een endotoxine gratis Maxi-prep-kit. Bereid plasmide DNA oplossing voor injectie gewenste concentraties in water en voeg Fast Green (eindconcentratie van 0,05%) injecties visualiseren. De efficiëntie van elektroporatie is sterk afhankelijk van de DNA-concentratie. Een concentratie van 1 pg / pl algemeen gebruikt. Deze concentratie is voldoende om geëlektroporeerde neuronen visualiseren zonder dat de ontwikkeling. Volgens de promoter in de plasmide vector (lage expressieniveau van cytomegalovirus promotor / enhancer sterke expressie van de cytomegalovirus immediate early enhancer en kip β-actine-promoter fusie (CAG) promoter) en de grootte en de stabiliteit van het eiwit uitgedrukt kan deze concentratie worden aangepast (0,25 ug / ul 5 pg / pl). Trek glas naalden met behulp van een micropipet trekker. 2. Voorbereiding van de Chirurgie Autoclaaf chirurgische instrumenten en fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). Bereid analgeticum in PBS (buprenorfine Vetergesic, eindconcentratie van 30 ng / ml). Weeg de zwangere muis en het injecteren subcutaan 0,1 mg / kg Vetergesic ten minste 30 minuten voor de operatie. Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de chirurgische gebied. Zet de verwarming pads en het herstel kamer. Leg steriele PBS in warm water bad en alle steriele instrumenten en materialen op steriele doeken. Plaats de platina-elektroden in een PBS gevulde beker en maak verbinding met de electroporator. Vul de naald met de DNA-oplossing met behulp van een microloader tip, sluit u de naald op de capillaire houder en knijp uit de punt van de naald met een tang. e_title "> 3. chirurgie Voordat DNA-injectie en elektroporatie Verdoof een zwangere muis (E14.5-E15.5) met isofluraan in zuurstof drager (zuurstof 2 l / min) met behulp van een verdovingsmiddel inductie kamer. Wacht tot het dier verliest oprichten van reflex. Breng het dier een "pre-chirurgie" masker. Breng een druppel ooggel op elk oog om ulceratie van de cornea van de ogen te voorkomen, terwijl de moeder is onder algemene verdoving. Gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar van de buik scheren. Maak een keer het geschoren gebied met clorhexidine voor het vliegtuig haren te verzamelen. Breng het dier een tweede masker in het operatiegebied. Plaats de muis met de rug op de mat. Start de operatie als het pedaal reflex is verloren gegaan. Doe masker en steriele handschoenen. Bedek het dier met een steriel laken (met een klein gaatje in de buik) naar de weefsels en instrumenten te voorkomen dat besmet door de gebieden van de huid die niet zijn geschoren en gedesinfecteerd. Reinig het geschoren gebied eent minstens 3 keer met clorhexidine. Gebruik een andere steriele wattenstaafje per keer. Gebruik een scalpel om een ​​verticale insnijding over de middellijn (~ 1 cm lang) maken door de huid. Met behulp van een schaar, een soortgelijke incisie van de spier van de buik langs de linea alba (witte lijn die hoofdzakelijk bestaat uit collageen bindweefsel). Kies de meest toegankelijke embryo's en plaats de ring tang tussen twee embryo's en embryonale zorgvuldig de keten te trekken uit de buikholte. Vanaf dit punt op, hou de embryo's gehydrateerd met een steriele voorverwarmde PBS. Geen microscoop nodig voor visualisatie. 4. Injectie van DNA en elektroporatie Beginnen met een van de laterale embryo, waardoor het gemakkelijker om waarvan embryo werden geëlektroporeerd houden. Niet te veel trekken aan de embryo's, omdat dit het risico van bloedingen verhogen. Manipuleer de positie van het embryo in de vruchtzak met behulp van de ring pincet enstabiliseren de kop van de embryo's tussen de ringen. Knijp voorzichtig bij het opdrijven van het embryo dichter bij de baarmoederwand. Met de andere hand neemt u de capillaire houder en zorgvuldig steek de naald in het midden van het halfrond aan de laterale ventrikel richten. Op de pedaal om ongeveer 1 ul DNA oplossing gemengd met Fast Green (minder dan 1 pi aan dendrieten bestuderen) injecteren. U moet houden aan de groene kleurstof het vullen van de laterale ventrikel. Kritische stappen: – De scherpte van de naald is van cruciaal belang te doorboren goed de baarmoederwand. Het is belangrijk de beweging van de naald minimaliseren aan het oppervlak van de uteruswand, na het inbrengen in de hartkamer door een vergroting van het gat zal resulteren in het verlies van vruchtwater en embryo dood. Vermijd piercing bloedvaten in de baarmoederwand, omdat dit zal resulteren in een bloeding en embryo dood. – Het is belangrijk om geen te grote hoeveelheid DNA injecteren in de laterale ventrikel, omdat het kan veroorzaken, zullenhydrocephalus (geen 2 ui niet meer bedragen dan E14.5). De hoeveelheid DNA is aangepast aan het doel van het experiment. Als 1 pi wordt algemeen gebruikt voor de meeste experimenten wordt een geringere hoeveelheid DNA (ongeveer 0,5 pi) nodig dendrieten en rug analyse. Inderdaad een paar geïsoleerde cellen dienen te worden gericht om te visualiseren en meten van de dendritische prieel van geëlektroporeerde neuronen. Plaats de elektroden op de zijkanten van het embryo kop met de positieve (+) paddle aan dezelfde zijde als de geïnjecteerde ventrikel voor cortex elektroporatie of aan de andere kant van de geïnjecteerde ventrikel voor hippocampus elektroporatie (figuur 2). Breng vijf 30V elektrische pulsen (50 msec duur) op 1 sec intervallen. Kritische stap: Vermijd toepassing van de huidige door de placenta, omdat dit zal resulteren in embryonale sterfte. Alle embryo's in een zwangere muis kan worden geëlektroporeerd, meestal met dezelfde DNA-construct om verwarring te voorkomen. Echter, een lange operatie daling is er aan de overleving van embryo's. De buikholte niet langer dan 30 min geopend. 5. Chirurgie Post-elektroporatie Na electroporating de embryo's, toe te voegen PBS in de buikholte en gebruik de ring tang om de baarmoeder hoorn weer op zijn oorspronkelijke locatie. Hecht de buik muur en de huid met Vicryl absorbeerbare hechtingen. Plaats het dier in een herstel van kamer tot hij wakker wordt (meestal 5-10 min) en vervolgens over in een kooi geplaatst op een verwarmingselement. 6. Post-operatie Controleer het gedrag van de muizen om pijn, lijden of angst te beoordelen en de dieren 24 uur en 48 uur af te wegen na de operatie. Indien nodig, kunnen pijnstillers worden toegediend om de pijn en ongemak te minimaliseren. 7. Weefsel bewerken Verzamel de geëlektroporeerde embryo's of pups op het embryo of de postnatale fase die nodig is voor het experiment. ove_content "> – Voor analyse op embryonale stadia (bijvoorbeeld om celproliferatie of migratie te bestuderen): Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie en het verzamelen van de embryo's. Na onthoofding de hersenen, die goed zijn geëlektroporeerd kiezen, zoals aangegeven door de hoeveelheid en de plaats van het fluorescentiesignaal, zichtbaar in de schedel met een fluorescerende binoculaire. Ontleden de hersenen uit de schedel en lossen 's nachts in 4% PFA en breng vervolgens in een 20% sucrose / PBS gedurende de nacht. Insluiten in OCT verbinding invriezen bij -80 ° C en deel met een cryostaat. – Voor de analyse op postnatale fase (bijvoorbeeld om dendrieten en stekels studie): Verdoven pups of volwassen muizen met intraperitoneale injectie van pentobarbitone (40-60 mg / kg) en voer transcardial perfusie met PBS, gevolgd door 4% PFA in PBS. Ontleden de hersenen uit de schedel en post-fix in 4% PFA 's nachts. Na het wassen in PBS, onderdeel van de hersenen met behulp van een vibratome (100 micrometer secties voor dendrite analyse). Monteer de secties in Aqua Poly / mount met behulp van 0.16-0.19 mm dik dekglaasjes om beeld dendrieten en stekels. 8. Representatieve resultaten Figuur 3 toont voorbeelden van geëlektroporeerde cellen in de cerebrale cortex (Figuren 3A, B) in de CA1 (figuren 3C, D) en de dentate gyrus de hippocampus (figuren 3E, F). Wild-type muizen werden geëlektroporeerd in E14.5 een GFP-construct (PCA-b-EGFPm5 demper 3) en geoogst op hersenen dagen na de geboorte (P) 14. Door injectie van een kleine hoeveelheid DNA-oplossing (0,5 ul of minder van een oplossing van 1 pg / pl), worden enkele cellen gelabeld, waardoor de visualisatie van de dendritische arborization geïsoleerde GFP + cellen (figuur 3) en de ruggen bij een grotere vergroting (figuur 4). <strong> Figuur 1. Schematische weergave van elektroporatie protocollen kunnen worden gebruikt om dendrieten en ruggen bestuderen. (A) elektroporatie van een GFP-construct te dendrieten en ruggen vergelijken wild-type en mutante muizen. (B) elektroporatie van GFP-shRNA (GFP tot expressie komen vanaf hetzelfde construct) om dendrieten en ruggen bij muizen werden geëlektroporeerd met een shRNA vergelijken construeren specifiek voor een gen van interesse (X) of een controle shRNA. (C) IUE kan worden gebruikt samen met een Cre induceerbare systeem om expressie van het shRNA beperken tot de gewenste tijdsperiode. In deze proef wordt een vector die een vorm van het Cre-recombinase dat geactiveerd kan worden door 4-hydroxytamoxifen (CAG-ER T2 creer T2, 1 pg / pl) 10 wordt geëlektroporeerd met een vector die een specifieke shRNA in Cre afhankelijke wijze (1 pg / pl en met een recombinatie indicator (CALNL-GFP-construct, GFP expressie geïnduceerd door Cre;. 1 pg / pl) 10 efficiencycy de knockdown kan worden verbeterd door de concentratie van de shRNA evenals meer CAG-ER T2 creer T2 concentratie. Figuur 2. Ruimtelijke controle van elektroporatie. Deze figuur toont waar het positioneren van de schoep elektrodes volgens de DNA injectie om de cerebrale cortex of hippocampus gericht. Figuur 3. Visualisatie van de dendritische prieel van in de baarmoeder geëlektroporeerd cellen in de cerebrale cortex en de hippocampus. (A, B) coronale secties met GFP + piramidale cellen in de hersenschors, (CD) piramidale cellen in CA1 van de hippocampus en (E, F), granule cellen in de dentate gyrus op P14. Een GFP construct (PCA-b-EGFPm5 geluiddemper 3) werd geëlektroporeerd op E14.5. Hogere vergroting foto's (B, D, F) blijkt dat de IUE is een efficiënte methode om dendrieten te visualiseren. Schaal staafjes 50 pm (B, D en F), 150 pm (A, C, E). Figuur 4. Visualisatie van dendritische 'spines in P14 neuronen die werden in de baarmoeder geëlektroporeerd op E14.5 met een GFP expressie te construeren. (A, B) Hoge vergroting beelden van de stekels van basale dendrieten van de hippocampus piramidale neuronen. Schaal staafjes 5 pm (A) en 2 pm (B).