להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em> ברחם</em> Electroporation
Summary
מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.
Abstract
ב electroporation ברחם (IUE) הפך טכניקה רבת עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של אזורים שונים של מערכת העצבים העוברית 1-5. עד היום בכלי זה נעשה שימוש נרחב על מנת ללמוד את הרגולציה של התפשטות התמיינות, וכן העברה עצבית בעיקר את קליפת המוח המתפתח 6-8. כאן יש פירוט הפרוטוקול שלנו electroporate ברחם קליפת המוח ואת ההיפוקמפוס לספק ראיות כי גישה זו ניתן ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.
ויזואליזציה ומניפולציה של נוירונים תרבויות עיקריות תרמו להבנה טובה יותר של התהליכים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ופיתוח סינפסה. עם זאת נוירונים הגדלים במבחנה אינם חשופים כל סימנים פיזיולוגיים שיכולים להשפיע על דנדריט ו / או יצירת עמוד השדרה ותחזוקה במהלך התפתחות תקינה. הידע שלנו של מבנים דנדריט ועמוד השדרה <eמ '> in vivo בעכברים wild-type או מוטציה מגיע בעיקר תצפיות בשיטת Golgi-קוקס 9. עם זאת, מכתים Golgi נחשב בלתי צפוי. אכן, קבוצות של תאים עצביים ועל קטעי סיבים מסומנים באופן אקראי, עם אזורים מסוימים מופיעה לעתים קרובות מוכתם לחלוטין בעוד אזורים סמוכים ללא כתמים. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי IUE של מבנים ניאון מהווה שיטה חלופית אטרקטיבית ללמוד דנדריטים, עמוד שדרה, כמו גם את הסינפסות עכברים שעברו מוטציה / wild-type 10-11 (איור 1 א). יתר על כן, בהשוואה לדור של knockouts עכבר, IUE מייצג גישה מהירה לבצע רווח והפסד של מחקרים פונקציה באוכלוסייה ספציפית של תאים במהלך חלון זמן מסוים. בנוסף, IUE שימש בהצלחה עם ביטוי הגן או מושרה מושרה RNAi מתקרב כדי לחדד את השליטה הזמני על הביטוי של הגן או shRNA 12. אלו יתרונות יש IUE ובכך openeד מימדים חדשים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי גנים / דיכוי על דנדריטים עם קוצים לא רק מבנים מוחיים ספציפיים (איור 1 ב), אלא גם בנקודת זמן מסוימת של פיתוח (איור 1 ג).
לבסוף, IUE מספקת כלי יעיל לזהות אינטראקציות תפקודית בין גנים המעורבים דנדריט, עמוד השדרה ו / או פיתוח סינפסה. ואכן, בניגוד לשיטות אחרות העברת גנים כמו וירוס, זה פשוט לשלב מספר רב של RNAi או transgenes באוכלוסייה זהה של תאים.
לסיכום, IUE היא שיטה רבת עוצמה אשר תרמו כבר אפיון של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תפקוד המוח ומחלות והיא צריכה להיות שימושית גם במחקר של דנדריטים עמוד השדרה.
Protocol
Discussion
IUE הוא כלי רב עוצמה כדי לתפעל ביטוי גנים לא רק במרחב אלא גם בזמן. אנחנו מראים כאן טכניקה זו ניתן להשתמש כדי להמחיש גנטית לתפעל דנדריטים הקוצים בקליפת המוח ו בהיפוקמפוס של עכברים. מלבד היתרונות שצוינו לעיל, ראוי לציין כי IUE, בניגוד Golgi השיטה, ניתן לשלב עם אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתרו, מה שמאפשר למשל פנוטיפ התאים electroporated. כמו כן, חשוב לציין כי הליך זה אינו לגרום מומים במוח שנרשמה למרות הפולשנות היחסי. בנוסף, ברמה התאית, IUE לא לשנות את המאפיינים של אלקטרו נוירונים electroporated 13. בעוד ההפגנה שלנו מתמקד להדמיה של מורפולוגיות דנדריט ועמוד השדרה, IUE של נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס ב E14.5 יכול לשמש גם כדי ללמוד את אירועי התפתחותיות אחרות כגון היווצרות האקסון והדרכה. בהוספהition, אותו סוג של פרוטוקול יכול להיות מיושם בשלבים אחרים של ההתפתחות העוברית למקד אוכלוסיות שונות. לדוגמה, הפרדיגמה electroporation התפתחותית מאוד קליפת המוח מאוחר E18.5 ניתן לבצע לנהוג ביטוי אבות astrocytic 1. באופן דומה, תוך electroporation של ההיפוקמפוס ב E14.5 מאפשר למקד-CA1 CA3 אבות נוירונים פירמידליים ו אב משוננת גרעין התא בו זמנית, electroporation ההיפוקמפוס מאוחר (E18.5 או לאחר לידה מוקדמת) תאפשר למקד גרגיר משוננת שונה אבות 14. במקרה זה, נפח מוזרק של ה-DNA יכול לגדול, כמו גם האינטנסיביות של הנוכחי.
Transgenes הציג IUE מופיעים להישאר episomal והם איבדו ולכן מתאים בעקבות חלוקות עוקבות. בתאים postmitotic כמו נוירונים, לעומת זאת, את transgenes episomal יישאר פעיל במשך חודשים לאחר electroporation המאפשר מחקרים ארוכי טווח 13, 15. במחקר שלנו, ראינו GFP בהיר + תאים עד 7 שבועות לאחר הלידה (נקודת הזמן האחרונה ניתחנו) המצביעים על כך עובריים המיקוד של מבשרי נוירונים בקליפת המוח או בהיפוקמפוס באמצעות תוצאות IUE בביטוי מתמשך של transgene מן המוקדמות נקודות זמן התפתחותיים עד לבגרות.
המגבלה הנוכחית של הטכניקה היא כי קשה להפעיל בקרה טובה על המספר הכולל של תאים electroporated. עם זאת, על ידי הפחתת נפח מוזרק של פתרון ה-DNA, הראינו כי ניתן לסמן מספר תאים ו לדמיין arborization הדנדריטים של תאים מבודדים + GFP, כמו גם עמוד שדרה. מימד של האזור transfected יכול גם להיות מותאם על ידי שינוי הפרמטרים של electroporation כגון עוצמת הזרם ומספר פעימות או בקוטר של משוטים electroporation.
בסך הכל IUE היא שיטה כי הוא קל ליישום, מהיריעיל ללמוד דנדריטים הקוצים vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ד"ר קתלין מאת'רס, ד"ר ז'אן פיליפ מוצ'ו וד"ר יולנדה סאבדרה טורס על עזרתם להופיע electroporation ברחם תחת נהלים אספטיים ועץ היילי על עזרתה להכין את הציורים.
EP נתמך על ידי הפדרציה ארוך טווח של חברות אירופיות ביוכימיות (FEBS) המילגה ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) פיתוח קריירה המילגה, MAH ידי קרן Wellcome מענק אליזבת פישר ויקטור Tybulewicz (080174/B/06/Z) , HW ידי לטווח ארוך EMBO המילגה ו RA ידי studentship MRC. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט של קרן Wellcome (086947/Z/08/Z) ועל ידי מענק-in-Aid מן המועצה למחקר רפואי (U117570528) כדי FG
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
| Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
| Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
| Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
| Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
| Material for surgery | ||||||
| Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
| Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
| Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
| Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
| Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
| Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
| Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
| Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
| Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
| Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
| Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
| Electroporation | ||||||
| Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
| Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
| Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
| Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
| Tissue processing | ||||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
| Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
| Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
| Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
| Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 | ||||
References
- Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders. Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).
- Castro, D. S. A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets. Genes Dev. 25, 930-945 (2011).
- Pacary, E. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69, 1069-1084 (2011).
- Marteau, L. Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon. Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).
- Ramon Moliner, E. . Comparative Methods in Neuroanatomy. , (1970).
- Banks, G. T. Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse. J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).
- Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
- Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation. J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).
- Nakahira, E., Yuasa, S. Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation. J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).
- Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX. Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).
