Эта статья подробно описывает протокол electroporate внутриутробно коры головного мозга и гиппокампа в E14.5 у мышей. Мы также показываем, что это ценный метод изучения дендритов и игл в этих двух мозговой регионах.
In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells.
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.
Институт экономики города является мощным инструментом для манипулирования экспрессии генов не только в пространстве, но и во времени. Здесь мы показываем, что этот метод может быть использован для визуализации и генетически манипулировать дендритов и игл в коре головного мозга и гиппокампа мышей. Кроме того, преимущества ранее упомянул, стоит отметить, что ИЭГ, в отличие от метода Гольджи, могут быть объединены с иммуногистохимии или гибридизация, которая позволяет, например, фенотип электропорации клеток. Важно также отметить, что эта процедура не вызывает пороки развития мозга очевидна, несмотря на его относительную инвазивности. Кроме того, на клеточном уровне, ИЭГ не изменяет электрофизиологические свойства нейронов электропорации 13. В то время как наша демонстрация посвящена визуализации дендритов и позвоночника морфологии, Институт экономики города корковых нейронов гиппокампа или в E14.5 также может быть использована для изучения других развитием событий, таких как формирование аксонов и руководства. В добавлениеition, такой же протокол может быть реализован и на других стадиях эмбрионального развития ориентированы на различные группы населения. Например, умственно очень поздно коры электропорации парадигмы в E18.5 могут быть выполнены, чтобы управлять экспрессией в астроцитарных предшественников 1. Кроме того, в то время как электропорации гиппокампа в E14.5 позволяет целевой СА1-пирамидальных CA3 предшественников нейронов и клеток-предшественников зубчатой гранул в то же время, поздно гиппокампа электропорации (E18.5 или раннем послеродовом) позволит ориентированы на различные зубчатой гранул предшественников 14. В этом случае вводится объем ДНК может быть увеличен, а также интенсивности тока.
Трансгенов введен ИЭГ, кажется, остаются эписомной и поэтому потерял из клеток после последовательных клеточных делений. В постмитотических клетки, такие как нейроны, однако, эписомной трансгенов остаются активными в течение месяца после электропорации позволяет долгосрочные исследования 13, 15. В нашем исследовании мы наблюдали яркий GFP + клеток до 7 недель после рождения (последнее момент времени мы проанализировали) о том, что эмбриональные ориентации корковых нейронов гиппокампа или прекурсоров использованием ИЭГ результатов в упорном выражение трансгена от раннего развития до момента времени к взрослой жизни.
Ограничение тока техники является то, что трудно оказывать точный контроль над общего числа электропорации клеток. Тем не менее, за счет уменьшения объема вводят раствор ДНК, мы показали, что можно пометить несколько клетки и визуализировать дендритных разветвление изолированных GFP + клеток, а также их шипами. Размерность трансфицированных области могут быть скорректированы путем изменения параметров электропорации, таких как силы тока и количества импульсов или диаметр электропорации весла.
Всего ИЭГ является методом, который прост в реализации, быстрым иэффективное изучение дендритов и игл в естественных условиях.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Кэтлин Mathers, д-р Жан-Филипп Mocho и д-р Иоланда Сааведра Торреса за их помощь для выполнения внутриутробно электропорации в асептических процедур и Хейли дерево за помощь в подготовке рисунков.
EP был поддержан долгосрочных Федерации европейских биохимических обществ (FEBS) общения и Medical Research Council (MRC), развитие карьеры общения, MAH по Wellcome Trust грант Элизабет Фишер и Виктор ФИЗИЧЕСКИХ НАУК (080174/B/06/Z) , HW по EMBO длительных стажировок и РА студенческие MRC. Эта работа была поддержана грантом проекта Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) и дотация из Медицинского исследовательского совета (U117570528) для FG
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |