Протокол для идентификации белок-белковых взаимодействий на основе¹⁵ N Метаболический маркировки, Иммунопреципитация, Количественный масс-спектрометрии и Affinity модуляции

1. Антитела адсорбции Взвесить 120 мг белка сефарозой в 15-мл коническую трубку (Falcon). Как 15 мг белка сефарозе необходимы для каждого иммунопреципитации (IP) этого количества достаточно для 8 IP-адресов. Добавьте 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), и пусть белка сефарозой волнения в течение 30 мин при 4 ° C. (Заметим, что все шаги, начиная с этого момента необходимо проводить в перчатках, чтобы избежать загрязнения с кератином и на льду, чтобы избежать деградации белков / диссоциации комплекса). Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения белков опухшие сефарозой. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4). Повторите этот шаг три раза мыть шарики тщательно. После последнего шага центрифугирования, удаления супернатанта и оставить примерно 0,5 мл фосфатного буфера. Добавить 0,9 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,4), 400мкл аффинно очищенные первичные антитела (50 мкл на IP) по отношению к белку-мишени (здесь HSP70B) и 16 мкл антител против белка контроля (здесь CF1β). Залейте DDH 2 O до общего объема 5 мл. (Заметим, что аффинно очищенные антитела должны быть использованы для уменьшения загрязнения неспецифические IgG,, которые мешают нано-LC-MS анализа – для протокола см. Willmund и др. (2005) 10 CF1β осаждается в виде управления загрузкой и был выбран.. потому что это есть в изобилии и, после лизиса клеток, присутствующих в растворимых и мембранных фракций. Кроме того, уровни загрязняющих белков могут быть использованы для нормализации для неравномерной нагрузке.) Разрешить белка сефарозой бисером адсорбировать IgG, во время 1-часовой инкубации при 25 ° С на трубе ролик (CAT RM5W, 36 мин). Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения белков сефарозой бисера. Осторожно удалите супернатант и гesuspend бусы в 5 мл 0,1 М бората натрия буфером (рН 9,0). Повторите это действие три раза, чтобы полностью удалить амины, которые бы утолить сшивающего агента. Взвесить 25,9 мг свежие, твердые dimethylpimelimidate и ресуспендируют она в 5 мл 0,1 М бората натрия буфером (рН 9,0) для получения конечной концентрации 20 мМ. Добавить это решение белка сефарозой бисера. Разрешить IgG, перекрестно ссылка белка в течение 30 мин при 25 ° С на трубе ролик. Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения бисера. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 5 мл 1 М Трис-HCl (рН 7,5), чтобы утолить бесплатно сшивающего агента. Повторите этот шаг еще раз и выдержать в течение 2 ч при 25 ° C или 12-24 ч при 4 ° С на трубе ролик. Дополнительно: если белка сефарозой бисером связан с IgG, которые непосредственно не используются для IP, для хранения до одной недели возможно. Для этого центрифуге в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C для осаждения бусы, осторожно удалите supernatant и ресуспендируют бусины в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5), содержащем 0,02% азида натрия и хранят при 4 ° С до дальнейшего использования. 2. Лизиса клеток, сшивания и подготовки проб Вырастить два Chlamydomonas культуры в среде, содержащей 7,5 мМ 14 NH 4 Cl или 15 NH 4 Cl в качестве источника азота до плотности ~ 5 х 10 6 клеток / мл. Клетки должны пройти по крайней мере, десять поколений для полной маркировки. Здесь, клетки были выращены photomixotrophically в среде TAP 11 на вращательное шейкере при 25 ° C при непрерывном облучении белым светом (30 мкЕ м -2 с -1). Передача две аликвоты каждого из 14 N и 15 N-меченых клеток до четырех GSA труб и урожай клеток 4-мин центрифугирования при 4000 х г и 4 ° C (номер ячейки собирают для каждой аликвоты зависит от сотовой концентрации целевой белка и должна быть определена электроннойmpirically заранее, чтобы обеспечить необходимый уровень белка-мишени выпадает в осадок. Хорошей отправной точкой является 10 9 клеток на аликвоты, т. е. 200 мл культуры с 5 х 10 6 клеток / мл.) Для сшивания только: в случае белковых комплексов будут сшиты до IP, клетки должны быть промывают, чтобы удалить аминов, присутствующих в среду. Для этого ресуспендирования клеток в 40 мл предварительно охлажденного KH буфера (20 мМ HEPES-KOH (рН 7,2), 80 мМ KCl) и передавать их в 50-мл Сокол труб. Центрифуга в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C. Повторите этот шаг один раз. Ресуспендируют клеток в 2 мл буфера для лизиса (20 мМ HEPES-KOH (рН 7,2), 1 мМ MgCl 2, 10 мМ KCl, 154 мМ NaCl), предварительно охлаждают до 4 ° C и передавать их в 15-мл Сокол труб. Соберите оставшиеся клетки в трубах GSA с дополнительным 1 мл буфера для лизиса каждый. Добавить 50 мкл 25 х ингибитор протеазы и 12,5 мкл 1 М MgCl 2 (до конечной концентрации 3,5 мм) для каждой аликвоты. Добавить 150мкл буфера для лизиса, 12,5 мкл 1 М ATP, 833 мкл 270 мМ фосфата креатина и 7 мкл 5 мкг / мкл креатинфосфокиназы (конечная концентрация составляет 2,5 мМ АТФ, 45 мМ креатинфосфата и 7 мкг / мл креатинфосфокиназы) к одному из аликвоты, содержащие 14 N и 15 N-меченых клеток (это + АТФ аликвоты). Добавить 930 мкл буфера для лизиса и 70 мкл 1 ед / мкл апиразы к другой аликвоты, содержащие 14 N и 15 N-меченых клеток (эти-ATP аликвоты). Выдержите в течение 2 мин при 25 ° С на трубе ролик установить ATP-разрушающих и АТФ-изобилует государства. Если сшивание шаг пропущен, добавить еще 1 мл буфера для лизиса. Для сшивания только: в случае, если исследуемый белок-белковых взаимодействий являются переходным желательно, чтобы захватить их сшивания шаг. Для этого добавьте 500 мкл 20 мМ дитио-бис (сукцинимидил пропионат) (DSP) растворяли в ДМСО (конечная концентрация составляет 2 мм) до еАх трубки непосредственно перед обработкой ультразвуком. Разрушать ультразвуком в четыре раза 20 секунд на льду сломать клетки с 20-сек перерывами для охлаждения. (Мы используем Bandelin Sonoplus HD2070 с KE76 наконечник на выходе контроль 75% и рабочий цикл 60%. Необходимые настройки для других машин / устройств / советы должны быть определены заранее, чтобы обеспечить полный лизис клеток и, чтобы не замарать. ) Для сшивания только: позволяет белковых комплексов для сшивания путем инкубации в течение 1 ч при 4 ° С на трубе ролик. После сшивания, дополняют друг трубки с 500 мкл 1 М глицин и инкубировать на трубе ролик в течение еще 15 мин при 4 ° C, чтобы утолить бесплатно сшивающего агента. Подготовьте четыре 6-мл сахарозы подушки (20 мМ HEPES-KOH (рН 7,2), 0,6 М сахарозы) в SW41 Ti тонкие стенки труб (Beckman Coulter Пункт №: 344059), аккуратно положите всего ~ 5,5 мл клеточных лизатов на сахарозу Подушки (баланс с буфером для лизиса) и центрифуги в течение 30 мин при 200000 х г и 4 ° C в SW41 Ti ротор. Переезд в верхней части градиента, содержащих растворимые белковые комплексы на четыре 15-мл пробирки Falcon (во избежание передачи части сахарозы подушке), добавить 350 мкл 10% Triton X-100 до конечной концентрации от 0,5% до каждого из них, тщательно перемешать и добавить лизис буфера в общем объеме 7 мл каждая. (Передача 70 мкл каждого растворимого экстракта клеток на свежий 1,5-мл конические пробирки (Эппендорфа) и добавить 70 мкл 2 х SDS-буфера для образца (4% SDS, 125 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 20% глицерина, 10 % 2-меркаптоэтанола), чтобы каждый для SDS-PAGE и иммуноблот анализа.) Откажитесь от сахарозы подушки и ресуспендирования мембраны гранул в 3 мл буфера для лизиса каждый. Добавить в каждую по 1 мл 10% Тритон Х-100 до конечной концентрации 2%, разрушать ультразвуком на льду для растворения гранул, а также добавить буфер для лизиса до общего объема 5 мл каждая. Подготовьте еще четыре 6-мл подушки сахарозы в SW41 Ti тонких трубок стене, лежал ~ 5 мл растворенного мембран, начиная с шага 2,10 внимательно на сахарозуподушки, и центрифуги в течение 30 мин при 200000 х г и 4 ° С в роторе SW41 Ti. Переезд в верхней части градиента, содержащих комплексы мембранного белка на четыре 15-мл пробирки Сокол и добавить лизис буфера (содержащего 2% Triton X-100) до конечного объема 7 мл каждая. (Передача 70 мкл каждого растворимого экстракта клеток на свежий Эппендорфа и добавить 70 мкл 2 х SDS-образца для каждого SDS-PAGE и иммуноблот анализа.) 3. Иммунопреципитация Гранулы белков сефарозой гранулы, содержащие связанные антитела (с шагом 1,8 или 1,9) по 60-сек центрифугированием при 1000 х г и 4 ° C, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 4 мл буфера для лизиса. Повторите этот шаг дважды, чтобы уравновесить бусины в буфере для лизиса. Заполнить до 8 мл буфера для лизиса и передать 1 мл суспензии для каждого из восьми 15-мл пробирки Сокол содержащие растворимые или мембранных комплексов белка с АТФ-сытые и АТФ-разрушающих 14 </sдо> N и 15 N-меченых клеток (с шагом 2,9 и 2,12). Выдержите в течение 2 ч при 4 ° С на трубе ролик комплексов осадок белка. Пелле бисера 60-сек центрифугированием при 1000 х г и 4 ° C и отбросить супернатант. Оставьте небольшой объем жидкости в верхней части бусины для облегчения передачи. Передача бусины из каждой пробирки Сокол 1,5-мл конические пробирки (Eppendorf трубки). Чтобы собрать все оставшиеся бусины в трубах Falcon, добавить еще 0,8 мл буфера для лизиса, содержащего 0,1% Triton друг, вихревой мягко, центрифуги в течение 60 сек при 1000 мкг и 4 ° C и передача буфера с остаточным бисером Эппендорфа. Труба обмена необходимо для предотвращения загрязнения из белков придерживаясь пластиковые стены. Пелле бисера 15-сек центрифугирования при 16100 х г и 4 ° C, осторожно удалите супернатант и ресуспендируют бусины в 1,3 мл буфера для лизиса, содержащего 0,1% Triton. Повторите этот шаг дважды лизис буферафер содержащие Triton и в два раза буфером для лизиса не хватает Triton тщательно мыть шарики. Оставьте небольшой объем жидкости в верхней части бусины для облегчения передачи. Опять же передать бисером на свежий 1,5-мл Eppendorf трубы для удаления белков, придерживаясь пластиковые стены. Вымойте старых труб с 1 мл буфера для лизиса не хватает Triton и передать все остаточные бисером свежие труб. Центрифуга в течение 15 сек при 16100 х г и 4 ° C, удалите супернатант сначала с нормальной пипетки, затем удалите оставшуюся супернатант полностью с 50-мкл шприца Гамильтона. 4. Подготовка проб для nano-LC-MS/MS Добавить 100 мкл свежеприготовленного элюции буфером (8 М мочевины, 25 мМ NH 4 HCO 3) в каждую пробирку, используя 100 мкл буфера элюирования, чтобы смыть бисером придерживаться шприца Гамильтона и инкубировать в течение 10 мин в Thermomixer при 800 оборотах в минуту и 65 ° C, а в течение еще ​​20 мин при 30 ° С (более полныйэлюирование связанных белков достигается за счет вымывания с 2% SDS осадков и последующие с 80% ацетона.) Центрифуга в течение 15 сек при 16100 мкг и 25 ° C. Передача супернатантов на свежий трубы с 50-мкл шприца Гамильтона. Добавить 50 мкл буфера для элюции с бисером, использовать 50 мкл буфера элюирования, чтобы смыть бисером придерживаться шприца Гамильтона и повторить инкубации и центрифугирования шаги 4,1 и 4,2, соответственно. Бассейн соответствующих элюатов. (Передача 30 мкл элюатов на свежий трубы Эппендорф, добавить 30 мкл 2 х SDS-буфера для образца, чтобы каждый для SDS-PAGE и иммуноблот анализа.) Комбинат Элюированную выпадает из + /-АТФ-лечение, 14 N и 15 N-меченных растворимых и мембранных белков следующим образом: 120 мкл 15 N / + АТФ и 120 мкл 14 N /-ATP 120 мкл 14 N / + АТФ и 120 мкл 15 N /-ATP 120 мкл 15 N / + АТФ и 120 мкл 14 N /-ATP <бр /> 120 мкл 14 N / + АТФ и 120 мкл 15 N /-ATP Добавить 1,5 мкл свежеприготовленного 1 M DTT до конечной концентрации 6,5 мМ каждого из четырех комбинаций для уменьшения дисульфидные связи (в том числе в сшивателя) и инкубировать в течение 30 мин при 25 ° C. Добавить 10,5 мкл свежеприготовленного 0,6 М иодацетамида до конечной концентрации 25 мМ до carboxymethylate пониженной тиолов и инкубировать в течение 20 мин при 25 ° C в темноте. Добавить 256 мкл 40 мМ NH 4 HCO 3 и 4 мкл Lys-C (0,1 мкг / мкл), печать труб с парафином, и инкубировать в течение по крайней мере 16 часов ночи на вращение колес при 37 ° C. Добавить 470 мкл 20 мМ NH 4 HCO 3, 10 мкл 100% ацетонитрила (до конечной концентрации 1%) и 8 мкл бисером трипсина, и инкубировать на вращение колеса по крайней мере 16 часов при 37 ° C. Центрифуга течение 5 мин при 16100 х г и 4 ° C, а супернатанты передачи на свежий 2-мл Eppendorf ваннойES. Вымойте старой трубы с 50 мкл 20 мМ NH 4 HCO 3, 0,5% уксусной кислоты, и бассейн с первым супернатантах. Для обессоливания, готовить домашние C 18-StageTips путем вырезания из двух дисков Empore C 18 материал с иглой шприца и размещение их в 200-мкл пипетки. Таким образом подготовить четыре 200-мкл советы. Пробивать отверстия в крышках из четырех 2-мл пробирки Eppendorf и вставки советов. Условие C 18-StageTips с 50 мкл раствора В (80% ацетонитрила, 0,5% уксусной кислоты). Центрифуга течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Уравновесьте C 18-StageTips с 100 мкл раствора (0,5%-ной уксусной кислоты, 2% ацетонитрил). Центрифуга течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторите этот шаг один раз. Загрузите 100 мкл супернатантов от триптического пищеварения (4,9) на C 18-StageTips и центрифуги в течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторяйте этот шаг до полного супернатанты были применены кстолбцы. Вымойте C 18-StageTips 100 мкл Центрифуга А. Решение течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторите этот шаг дважды. Элюировать триптических пептидов в свежий 1,5-мл трубки Эппендорф с 50 мкл раствора B. центрифуги в течение 3 мин при 800 г и 25 ° C. Повторите этот шаг один раз. Сухие пептиды до завершения в скорости переменного тока. Дополнительно: печать Эппендорфа с парафином и хранят при температуре -80 ° C до дальнейшего использования. Ресуспендируют сушеные пептидов с 20 мкл раствора и инкубировать в течение не менее 1 часа на льду, прервал на два 15-минутных инкубации в ультразвукового ванны. Центрифуга течение 20 мин при 16100 х г и 4 ° C, и применять супернатанта nano-LC-MS/MS. 5. Представитель Результаты Как показали образцово на 14 N-меченных клеточных экстрактов в рисунке 2А, HSP70B и CGE1 почти исключительно локализованы в растворимой фракции, независимые от государства АТР. ВНапротив, CF1β локализуется в растворимых и мембранных обогащенных фракций, а ультразвуком ножницы частью его от мембраны расположены CF-о, и, следовательно, служит в качестве контроля загрузки для обеих фракций. Как показано на Рисунке 2B, одинаковое количество HSP70B осаждали с анти-HSP70B антител из 14 N и 15 N-меченных растворимых экстрактов, независимых от государства АТР. В противоположность этому, только немного HSP70B осаждали из мембранных фракций с немного большем количестве, происходящих из АТФ-обедненной фракции мембран по сравнению с ATP изобилует фракций, следовательно, подтверждающие ранее результаты 9. Нет CGE1 был совместно осаждают HSP70B в ATP-изобилует растворимый или мембранной фракции, в то время как большое количество CGE1 были совместно осаждают HSP70B из АТФ обедненного растворимых фракций, и немного от ATP-обедненной фракции мембран. Взаимодействие с CGE1 HSP70B только в состоянии ADP наблюдается также вMS анализа: на рисунке 3, представитель MS1 спектров HSP70B и CGE1 пептидов из осадка, созданных с помощью HSP70B антисыворотки от растворимых клеточных экстрактов показано. В эксперименте показано на рисунке 3А, осадок из смеси 14 N-меченных экстракты не хватает АТФ и 15 N-меченных экстракты, содержащие ATP. В то время как тяжелые и легкие формы помечены HSP70B пептида были обнаружены при равной интенсивности, только свет помечены форме CGE1 пептид (от АТФ выдержки) был найден. На рисунке 3B же пептиды из анти-HSP70B осадок, полученных из смесей взаимно меченого растворимого экстракта клеток показано на рисунке. Соответственно, на этот раз только тяжелые помечены формы пептида CGE1 (от ATP-экстракты) было обнаружено, в то время это был снова случай для обоих, легкой и тяжелой меченых пептидов HSP70B. <сильная> Рисунок 1. Экспериментальный процесс. Клетки метаболически меченных 14 N и 15 N в течение по крайней мере 10 поколений, собирают и поставляется с обедненным или от СПС. После лизиса клеточных комплексов белков необязательно может быть сшитым (X-Link) с DSP. Лизированных клеток отделяются в растворимой (Sol) и мембранный обогащенный (PEL) фракций. Целевая белков (здесь HSP70B) и контрольного белка (здесь CF1β), которые иммунопреципитации с специфических антител связан с белком сефарозе бисером (черный). После промывки осажденного белки элюируют и непосредственно проанализированы с помощью иммуноблоттинга или соответствующих 14 N и 15 N-меченных фракций + АТФ и АТФ государства объединяют, перевариваются и проанализированы nano-LC-MS/MS. В примере, показанном случае здесь 15 N-меченных фракции был исчерпан от СПС. Соответственно, соотношение интенсивностей тяжелых маркировкой (темного цвета), чтобы осветить маркировкой (светлых тонов) пептидов из белков контроль(CF1β), белка-мишени (HSP70B) и неспецифически связанного загрязнений должно быть около одного, в то время как этот показатель ожидается на очень высоком для белков конкретно взаимодействует с белком-мишенью (CGE1). Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 2. Анализ вход для иммунопреципитации HSP70B. Общий белок был извлечен из растворимых (Sol) и мембранный обогащенный (PEL) фракций либо истощены от АТФ (АТФ) или дополнены с АТФ и АТФ система регенерации (+ АТФ). 0,01% белка экстракты разделяют на 10% SDS-полиакриламидном геле, и уровни HSP70B и CGE1 белка по сравнению с контролем загрузки CF1β были проанализированы с помощью иммуноблоттинга. B Анализ иммунопреципитатах. HSP70B был иммунопреципитации из 14 N-и15 N-меченных растворимых и мембранных обогащенного клеточные экстракты, содержащие или не хватает АТФ. Белки соответствующего 3,3% иммунопреципитатах были разделены на 10% SDS-полиакриламидном геле и уровней HSP70B и CGE1 относительно контроля загрузки CF1β были проанализированы с помощью иммуноблоттинга. Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 3. Представитель масс-спектры HSP70B и CGE1 пептидов из анти-HSP70B иммунопреципитаты осуществляется на смешанной растворимых фракций (14 N-ATP / 15 N + АТФ). Полный спектр МС 14 N и 15 N меченых пептидов, соответствующих АТФ и + ATP государства, соответственно, от HSP70B и сотрудничество иммунопреципитации CGE1 показано. Оба пептиды трехзарядных, пептид HSP70B содержит 22 атомов азота, CGE1 peptязь 19, соответствующий сдвиг массы, равного 7,33 и 6,33 м / г, соответственно. B представителя масс-спектров от обратного эксперимента (14 N + ATP / 15 N-АТФ). Полный спектр MS того же 14 N и 15 N меченых пептидов, вот соответствующая + АТФ и АТФ государства, соответственно, от HSP70B и сотрудничество иммунопреципитации CGE1 показано. Нажмите, чтобы увеличить показатель .