El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de¹⁵ N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

1. La adsorción de anticuerpos Pesar 120 mg de proteína A Sepharose en un tubo cónico de 15-ml (Falcon). Como 15 mg Proteína A-Sepharose se necesita para cada inmunoprecipitación (IP), esta cantidad es suficiente para 8 IPs. Añadir 5 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) y dejar que la Proteína A Sepharose se hinchan durante 30 min a 4 ° C. (Tenga en cuenta que todos los pasos de este punto sobre el que se lleva a cabo con guantes para evitar la contaminación con la queratina y en hielo para evitar la degradación de proteínas / disociación complejo.) Centrifugar durante 60 segundos a 1.000 xg y 4 ° C para sedimentar la proteína A Sepharose hinchada. Retirar con cuidado el sobrenadante y resuspender las perlas en 5 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Repita este paso tres veces para lavar las perlas a fondo. Después del último paso de centrifugación, eliminar el sobrenadante y dejar aproximadamente 0,5 ml de tampón de fosfato. Añadir 0,9 ml de 0,5 M de tampón fosfato (pH 7,4), 400l afinidad purificado anticuerpos primarios (50 l por IP) contra la proteína diana (aquí hsp70B), y 16 mu l anticuerpos contra una proteína de control (aquí CF1β). Llenar con ddH 2 O hasta un volumen total de 5 ml. (Tenga en cuenta que los anticuerpos purificados por afinidad se debe utilizar para reducir la contaminación por las IgG inespecíficos, que interfieren con nano-LC-MS análisis – por un protocolo ver Willmund et al (2005) 10 CF1β se precipita como control de carga y fue elegido.. porque es abundante y, después de la lisis celular, presentes en fracciones soluble y de membrana. alternativa, los niveles de proteínas contaminantes se pueden utilizar para normalizar para la carga desigual.) Permitir Proteína A Sepharose bolas a IgGs de adsorber durante una incubación de 1-hr a 25 ° C sobre un rodillo de tubo (CAT RM5W, 36 rpm). Centrifugar durante 60 segundos a 1.000 xg y 4 ° C para sedimentar la proteína A Sepharose. Retire con cuidado el sobrenadante y resuspend las perlas en 5 ml de 0,1 M de tampón borato de sodio (pH 9,0). Repita este paso tres veces para eliminar completamente las aminas que apagan el agente de reticulación. Pesar 25,9 mg de fresco, sólido dimethylpimelimidate y resuspender en 5 ml de tampón borato 0,1 M de sodio (pH 9,0) para obtener una concentración final de 20 mM. Añadir esta solución a la proteína A Sefarosa. Permitir IgG para reticular a la proteína A durante 30 min a 25 ° C sobre un rodillo de tubo. Centrifugar durante 60 segundos a 1.000 xg y 4 ° C para sedimentar las perlas. Retirar con cuidado el sobrenadante y resuspender las perlas en 5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,5) para apagar reticulante libre. Repetir este paso una vez y se incuba durante 2 horas a 25 ° C o 12-24 horas a 4 ° C en un tubo enrollador. Opcional: si proteína A Sepharose bolas unidas a IgG no son utilizados directamente por IP, almacenamiento de hasta una semana es posible. Para ello, se centrifuga durante 60 segundos a 1.000 xg y 4 ° C para sedimentar las perlas, retirar cuidadosamente el supernperlas atant y se resuspende en 5 ml de tampón fosfato 0,1 M (pH 7,5) que contenía 0,02% de azida de sodio y se almacena a 4 ° C hasta su uso posterior. 2. Lisis celular, la reticulación y Preparación de Muestras Crecer dos cultivos de Chlamydomonas en medio que contiene 7,5 mM NH 4 Cl 14 o 15 NH 4 Cl como fuente de nitrógeno a una densidad de ~ 5 x 10 6 células / ml. Las células necesitan para pasar por lo menos diez generaciones de etiquetado completo. Aquí, las células se cultivaron en medio TAP photomixotrophically 11 en un agitador rotatorio a 25 ° C bajo irradiación continua con luz blanca (30 μE m -2 s -1). Transferir dos partes alícuotas de cada una de 14-N y 15 N-etiquetados células a cuatro tubos GSA y células de cosecha mediante una centrifugación de 4 min a 4.000 xg y 4 º C (El número de células cosechadas para cada alícuota depende de la concentración celular de la diana proteína y de las necesidades que se determinen empirically de antemano para asegurar que suficiente proteína diana se precipita. Un buen punto de partida es 10 9 células por alícuota, es decir, 200 ml de un cultivo con 5 x 10 6 células / ml.) Para la reticulación sólo: en el caso de complejos de proteínas se reticula antes de IP, las células necesitan ser lavados para eliminar las aminas presentes en el medio. Para esto, las células se resuspenden en 40 ml de tampón enfriado previamente KH (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) y transferirlos a 50-ml tubos Falcon. Centrifugar durante 60 segundos a 1.000 xg y 4 º C. Repita este paso una vez. Resuspender las células en 2 ml de tampón de lisis (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) enfriado previamente a 4 ° C y transferirlos a 15-ml tubos Falcon. Recoger las células que quedan en los tubos de GSA con un adicional de tampón de lisis 1 ml cada una. Añadir 50 l 25 x inhibidor de la proteasa y 12,5 l 1 M de MgCl 2 (a una concentración final de 3,5 mM) a cada alícuota. Añadir 150El tampón de lisis l, 12,5 l 1 M ATP, 833 l de fosfato de creatina 270 mM y 7 l 5 g / l de creatina fosfoquinasa (la concentración final es de 2,5 mM ATP fosfoquinasa, 45 mM fosfato de creatina, y 7 mg / ml de creatina) a uno de los las alícuotas que contienen N-14 y N-15 células marcadas (estas son las alícuotas + ATP). Añadir 930 l tampón de lisis y 70 l U 1 / l apirasa a las alícuotas que contengan N-14 y N-15 células marcadas (estas son las alícuotas-ATP). Incubar durante 2 min a 25 ° C en un tubo enrollador para establecer ATP-agotan y estados ATP repletas. Si la etapa de reticulación se omite, añadir otro 1 ml de tampón de lisis. Para la reticulación sólo: en el caso de los investigados interacciones proteína-proteína son transitorios es aconsejable para su captura por una etapa de reticulación. Para ello, añadir 500 l 20 mM ditio-bis (propionato de succinimidilo) (DSP) disuelto en DMSO (concentración final es 2 mM) a eada tubo directamente antes de sonicación. Sonicar cuatro veces 20 segundos en hielo para romper las células con 20-seg pausas entre ellos para que se enfríen. (Utilizamos el Bandelin Sonoplus HD2070 con una punta KE76 en el control de salida del 75% y el ciclo de trabajo del 60%. Los ajustes necesarios para otras máquinas / aparatos / consejos necesario determinar con antelación para asegurar la lisis completa de las células y para evitar derrames. ) Para la reticulación sólo: permitir que los complejos de proteínas de reticular por incubación durante 1 hora a 4 ° C en un tubo enrollador. Después de la reticulación, complementar cada tubo con 500 l de glicina 1 M y se incuba sobre un rodillo de tubo para otros 15 min a 4 ° C para inactivar reticulante libre. Preparar cuatro 6 ml almohadillas de sacarosa (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M de sacarosa) en SW41 Ti tubos de pared delgada (Beckman Coulter Artículo n º: 344059), coloque cuidadosamente la totalidad ~ 5,5 ml de lisados ​​celulares sobre la sacarosa cojines (equilibrio con tampón de lisis) y se centrifuga durante 30 minutos a 200.000 xg y 4 ° C en un roto SW41 Tir. Transferir la parte superior del gradiente que contiene complejos de proteína soluble en cuatro 15-ml (tubos Falcon de evitar la transferencia de partes del colchón de sacarosa), añadir 350 l 10% de Triton X-100 a una concentración final de 0,5% para cada uno de ellos, mezclar cuidadosamente y añadir tampón de lisis hasta un volumen total de 7 ml cada una. (Transferencia de 70 l de cada extracto celular soluble a nuevos 1,5-ml tubos cónicos (tubos Eppendorf) y añadir 70 l 2 x SDS-tampón de muestra (4% de SDS, 125 glicerol mM Tris-HCl (pH 6,8), 20%, 10 % de 2-mercaptoetanol) a cada uno por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia.) Desechar los cojines de sacarosa y resuspender los gránulos de membrana en tampón de lisis 3 ml cada una. Añadir a cada 1 ml de 10% de Triton X-100 a una concentración final de 2%, sonicado en hielo para disolver pellets, y añadir tampón de lisis hasta un volumen total de 5 ml cada uno. Preparar otros cuatro de 6 ml cojines de sacarosa en SW41 Ti tubos de paredes delgadas, coloque el ~ 5 ml de membranas solubilizadas de paso 2,10 cuidadosamente sobre la sacarosacojines, y se centrifuga durante 30 min a 200.000 x g y 4 ° C en un rotor SW41 Ti. Transferir la parte superior del gradiente que contiene complejos de proteínas de membrana en cuatro 15-ml tubos Falcon y añadir tampón de lisis (que contiene 2% de Triton X-100) hasta un volumen final de 7 ml cada una. (Transferencia 70 l de cada extracto celular soluble a fresco Eppendorf tubos y añadir 70 l 2 x SDS-muestra para cada uno por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia.) 3. Immunoprecipitation Pellet la proteína A Sepharose bolas que contienen anticuerpos acoplados (pasos de 1,8 o 1,9) mediante una centrifugación de 60-segundos a 1.000 xg y 4 º C, retirar cuidadosamente las perlas sobrenadante y se resuspende en 4 ml de tampón de lisis. Repita este paso dos veces para equilibrar perlas en tampón de lisis. Llenar hasta 8 ml con tampón de lisis y transferir 1 ml de la suspensión a cada uno de los ocho 15-ml que contienen tubos Falcon de complejos de proteínas solubles o de membrana a partir de ATP y ATP-repleta agotan-14 </shasta> N-15 y N-etiquetados células (del paso 2,9 y 2,12). Incubar durante 2 horas a 4 ° C en un tubo enrollador para precipitar los complejos de proteínas. Sedimentar las perlas mediante una centrifugación de 60-segundos a 1.000 xg y 4 º C y desechar los sobrenadantes. Deja un pequeño volumen de líquido en la parte superior de las perlas para facilitar la transferencia. Transferir las perlas de cada tubo Falcon de 1,5-ml cónico de tubos (tubos Eppendorf). Para recoger todas las perlas restantes en los tubos Falcon, añadir otro 0,8 ml de tampón de lisis que contiene 0,1% de Triton a cada uno, vórtice suavemente, se centrifuga durante 60 segundos a 1.000 xg y 4 º C y transferir el tampón con los granos residuales a los tubos Eppendorf. Tubo de cambio es necesario para evitar contaminaciones de las proteínas que se adhieren a las paredes de plástico. Sedimentar las perlas mediante una centrifugación de 15-segundos a 16.100 xg y 4 º C, retirar cuidadosamente los sobrenadantes y se resuspenden las perlas en 1,3 ml de tampón de lisis que contiene 0,1% de Triton. Repita este paso dos veces con buf lisisfer contiene Triton Triton y dos veces con tampón de lisis que carecen de lavar bien las cuentas. Deja un pequeño volumen de líquido en la parte superior de las perlas para facilitar la transferencia. Una vez más la transferencia de los granos frescos de 1,5-ml tubos Eppendorf para eliminar las proteínas que se adhieren a las paredes de plástico. Lavar los tubos viejos con 1 ml de tampón de lisis Triton falta y transferir todas las cuentas residuales de los tubos nuevos. Centrifugar durante 15 segundos a 16.100 xg y 4 º C, retirar los sobrenadantes primero con una pipeta normal, a continuación, eliminar cualquier resto de sobrenadante completamente con una jeringa de 50-l Hamilton. 4. Preparación de muestras para nano-LC-MS/MS Añadir 100 l tampón de elución recién preparada (8 M urea, 25 mM NH 4 HCO 3) a cada tubo, utiliza el tampón de elución 100 l de lavar granos se pegan a la jeringa de Hamilton y se incuba durante 10 min en un termomezclador a 800 rpm y 65 ° C, y durante otros 20 min a 30 ° C. (A mucho más completaelución de las proteínas unidas se consigue mediante elución con 2% SDS y posterior precipitación con acetona al 80%.) Centrifugar durante 15 segundos a 16.100 xg y 25 ° C. Transferir los sobrenadantes a tubos nuevos con una jeringa de 50-l Hamilton. Añadir 50 l de tampón de elución las cuentas, usar el buffer de elución 50 l para lavar granos se pegan a la jeringa Hamilton y repita los pasos de incubación y centrifugación 4,1 y 4,2, respectivamente. Piscina para los eluidos correspondientes. (Transferencia de 30 l de los eluidos a nuevos tubos Eppendorf, añadir 30 l 2 x SDS-tampón de muestra a cada uno por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia.) Combinar el eluido se precipita de + /-ATP-tratada, 14 N-15 y N-etiquetados proteínas solubles y de membrana como sigue: 120 l 15 N / + ATP y 120 l 14 N / ATP- 120 l 14 N / + ATP y 120 l 15 N / ATP- 120 l 15 N / + ATP y 120 l 14 N / ATP-<br /> 120 l 14 N / + ATP y 120 l 15 N / ATP- Añadir 1,5 l recién preparada DTT 1 M a una concentración final de 6,5 mM para cada una de las cuatro combinaciones para reducir los enlaces disulfuro (incluidos los del agente de reticulación) y se incuba durante 30 min a 25 ° C. Añadir 10,5 l recién preparada de yodoacetamida 0,6 M a una concentración final de 25 mM a carboxymethylate los tioles reducidos e incubar durante 20 min a 25 ° C en la oscuridad. Añadir 256 l 40 mM NH 4 HCO 3 y 4 l Lys-C (0,1 g / l), los tubos de sellado con parafilm y se incuba durante al menos 16 horas durante la noche en una rueda de rotación a 37 º C. Añadir 470 l 20 mM NH 4 HCO 3, 10 l de acetonitrilo 100% (a una concentración final de 1%) y 8 perlas de tripsina mu l, e incubar en una rueda de rotación durante al menos 16 horas a 37 ° C. Centrifugar durante 5 min a 16.100 xg y 4 ° C, y los sobrenadantes de transferencia a fresca de 2 ml bañera Eppendorfes. Lavar los tubos viejos con 50 l 20 mM NH 4 HCO 3, 0,5% de ácido acético, y la piscina con sobrenadantes primero. Para la desalinización, la preparación casera C 18-StageTips cortando dos discos de Empore C 18 material con una aguja de jeringa y colocándolos en una punta de pipeta de 200-l. De esta manera preparar cuatro de 200 mu l consejos. Haga agujeros en las tapas de los cuatro de 2 ml tubos Eppendorf y puntas de inserción. Condición previa el C 18-StageTips con 50 l Solución B (80% de acetonitrilo, 0,5% de ácido acético). Centrifugar durante 3 min a 800 g y 25 ° C. Equilibrar el C 18-StageTips con 100 l Solución A (0,5% de ácido acético, 2% de acetonitrilo). Centrifugar durante 3 min a 800 g y 25 ° C. Repita este paso una vez. Cargar 100 l de los sobrenadantes a partir de las digestiones trípticas (4,9) sobre el C 18-StageTips y centrifugar durante 3 minutos a 800 g y 25 ° C. Repita este paso hasta que los sobrenadantes completos se aplicaron alas columnas. Lavar el C 18-StageTips con 100 l Centrifugadora A. Solución durante 3 min a 800 g y 25 ° C. Repita este paso dos veces. Eluir los péptidos trípticos en una fresca 1,5-ml tubo Eppendorf con 50 l Solución B. centrífuga durante 3 minutos a 800 g y 25 ° C. Repita este paso una vez. Péptidos seco hasta su finalización en un Speed ​​Vac. Opcional: sello Eppendorf tubos con parafilm y se almacena a -80 ° C hasta su posterior utilización. Resuspender los péptidos secos con 20 l Solución A y se incuba durante al menos 1 hora en hielo, interrumpido por dos incubaciones de 15-min en un baño sonicador. Centrifugar durante 20 min a 16.100 xg y 4 ° C, y se aplican a nano-LC-MS/MS sobrenadante. 5. Los resultados representativos Como se muestra ejemplarmente para los extractos celulares 14 N-etiquetados en la Figura 2A, hsp70B y CGE1 se localizan casi exclusivamente a la fracción soluble, independiente del estado de ATP. EnPor el contrario, CF1β se localiza en las fracciones solubles y de membrana enriquecido, como sonicación tijeras de parte de ella a partir de la membrana situada o CF, y por lo tanto sirve como control de carga para ambas fracciones. Como se muestra en la Figura 2B, cantidades similares de hsp70B fueron precipitadas con los anticuerpos anti-hsp70B de 14 N-15 y N-etiquetados extractos solubles, independientes del estado ATP. En contraste, sólo hsp70B poco se precipitó a partir de fracciones de membrana con cantidades ligeramente más grandes procedentes de fracciones de membrana con depleción de ATP en comparación con fracciones ATP repletas, por lo tanto, corroborando resultados anteriores 9. No CGE1 fue co-precipitado con hsp70B en el ATP repletas de fracciones solubles o membrana, mientras que grandes cantidades de CGE1 fueron co-precipitado con hsp70B de ATP-agotadas las fracciones solubles y poco a partir de fracciones de membrana ATP-agotado. La interacción de CGE1 con hsp70B sólo en el estado ADP se observa también en laAnálisis MS: en la Figura 3, representante MS1 espectros de hsp70B y CGE1 péptidos de precipitados generados con el antisuero hsp70B partir de extractos celulares solubles se muestran. En el experimento mostrado en la figura 3A, los precipitados se partir de mezclas de 14 N-etiquetados extractos que carecen de ATP y 15 N-etiquetados extractos que contienen ATP. Mientras que la forma ligera y pesada etiqueta del péptido hsp70B se detectaron a intensidades iguales, sólo la forma de luz rotulado del péptido CGE1 (a partir de extractos-ATP) se encontró. En la figura 3B los mismos péptidos a partir del precipitado anti-hsp70B derivarse de mezclas de extractos de células marcadas recíprocamente solubles se muestran. En consecuencia, esta vez sólo la forma pesada etiqueta del péptido CGE1 (de extractos-ATP) se detectó, mientras que este volvió a ser el caso para los dos, ligeras y pesadas péptidos marcados hsp70B. <strong> la figura 1. Experimentales de flujo de trabajo. Las células son metabólicamente marcada con 14 N y 15 N durante al menos 10 generaciones, se recogieron y se suministra con o empobrecido a partir de ATP. Después de complejos de proteínas de células de lisis puede estar opcionalmente reticulado (X-link) con DSP. Las células lisadas se separan a continuación en soluble (Sol) y fracciones enriquecidas de membrana (PEL). Las proteínas diana (aquí hsp70B) y una proteína de control (aquí CF1β) se inmunoprecipitaron con anticuerpos específicos unidos a la proteína A sepharose (negro). Después del lavado, las proteínas precipitadas, se eluyen y, o bien analizarse directamente mediante inmunotransferencia, o los respectivos 14 N-15 y N-etiquetados en fracciones + ATP y ATP-estados se reúnen, se digiere y se analizaron por nano-LC-MS/MS. En el caso del ejemplo que se muestra aquí la fracción 15 N-etiquetados se agotó a partir de ATP. Péptidos en consecuencia, la relación de intensidades de pesados ​​etiquetados (colores oscuros) a la luz etiquetados (colores de luz) de la proteína de control(CF1β), la proteína diana (hsp70B) y no específicamente los contaminantes unidos debe estar alrededor de uno, mientras que esta proporción se espera que sea muy alta para las proteínas que interactúan específicamente con la proteína diana (CGE1). Haga clic aquí para ampliar la figura . Figura 2. Un análisis de la entrada para la inmunoprecipitación hsp70B. Proteína total se extrajo de soluble (Sol) y la membrana enriquecido (Pel) fracciones ya sea agotados de ATP (-ATP) o suplementado con ATP y un sistema de regeneración de ATP (+ ATP). 0,01% de los extractos de proteínas se separaron en un 10% de SDS-gel de poliacrilamida, y los niveles de hsp70B y CGE1 proteína en relación con CF1β control de carga se analizaron por inmunotransferencia. B Análisis de los inmunoprecipitados. Hsp70B fue inmunoprecipitado a partir de 14 y N-15 N-etiquetados soluble y de membrana enriquecida con extractos celulares que contienen o que carecen de ATP. Las proteínas que corresponden al 3,3% de los inmunoprecipitados se separaron en un 10% SDS-gel de poliacrilamida y los niveles de hsp70B y relativos a la carga CGE1 CF1β control fueron analizados por inmunotransferencia. Haga clic aquí para ampliar la cifra . Figura 3. Un espectro de masas Representante de hsp70B y CGE1 péptidos a partir de inmunoprecipitados anti-hsp70B realiza en mixtos fracciones solubles (14 N-ATP / N + 15 ATP). Completo espectros de MS de 14 N y 15 N péptidos etiquetados, que corresponden a la ATP-y + estados ATP, respectivamente, de hsp70B y CGE1 co-inmunoprecipitadas se muestran. Ambos péptidos se triplemente cargado, el péptido hsp70B contiene 22 átomos de nitrógeno, el Pept CGE1ide 19, que corresponde a un desplazamiento de masa de 7,33 y 6,33 m / z, respectivamente. Representante B espectros de masas del experimento recíproco (14 N + ATP / 15 N-ATP). Completo espectros MS de los mismos 14 N y 15 N péptidos etiquetados, aquí correspondientes a la ATP + y ATP estados, respectivamente, de hsp70B y CGE1 co-immunoprecipitated se muestran. Haga clic aquí para ampliar la cifra .