Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado¹⁵ Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

1. Anticorpo Adsorção Pesar 120 mg de proteína A Sepharose num tubo cónico de 15 ml (Falcon). Como 15 mg Proteína A Sepharose é necessário para cada imunoprecipitação (IP), este montante é suficiente para 8 IPs. Adicionar 5 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) e deixe que a Proteína A Sepharose inchar durante 30 min a 4 ° C. (Note-se que todas as etapas a partir deste ponto de ser realizada com luvas para evitar a contaminação com a queratina e em gelo para evitar a degradação de proteína / dissociação complexo). Centrifugue durante 60 segundos a 1000 xg e 4 ° C para sedimentar a proteína A-Sepharose inchada. Cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender as contas em 5 ml de tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4). Repetir esta etapa, três vezes para lavar as pérolas completamente. Após o último passo de centrifugação, remover o sobrenadante e deixar cerca de 0,5 ml de tampão de fosfato. Adicionar 0,9 ml de 0,5 M de tampão de fosfato (pH 7,4), 400afinidade purificados anticorpos primários ul (50 ul por IP) contra a proteína alvo (aqui HSP70B), e 16 ul de anticorpos contra uma proteína de controlo (aqui CF1β). Encha-se com DDQ 2 O para um volume total de 5 ml. (Note-se que os anticorpos purificados por afinidade deve ser utilizado para reduzir a contaminação por IgGs não específicos, o que interfere com o nano-LC-MS análise – para um protocolo de ver Willmund et al (2005) 10 CF1β é precipitado como um controle de carregamento e foi escolhido.. porque é abundante e, após a lise das células, presentes nas fracções solúveis e de membrana. Alternativamente, os níveis de proteínas contaminantes podem ser utilizados para normalizar para carregamento desigual.) Permitir pérolas de Sepharose de Proteína A para IgGs adsorver durante uma incubação de 1 hora a 25 ° C em um tubo de rolo (CAT RM5W, 36 rpm). Centrifugue durante 60 segundos a 1000 xg e 4 ° C para sedimentar a proteína A Sepharose grânulos. Cuidadosamente remover o sobrenadante e resuspend as contas em 5 ml de 0,1 M de tampão de borato de sódio (pH 9,0). Repetir esta etapa, três vezes para remover completamente as aminas que suprimem o reticulador. Pesar 25,9 mg de fresco, sólido dimethylpimelimidate e ressuspender em 5 ml de 0,1 M de tampão de borato de sódio (pH 9,0) para se obter uma concentração final de 20 mM. Juntar esta solução à Proteína A Sepharose grânulos. Permitir IgGs de ligação transversal de Proteína A durante 30 min a 25 ° C em um tubo de rolo. Centrifugue durante 60 segundos a 1000 xg e 4 ° C para sedimentar as pérolas. Cuidadosamente remover o sobrenadante e ressuspender as contas em 5 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,5) para extinguir reticulador livre. Repetir este passo uma vez e incubadas durante 2 horas a 25 ° C ou 12-24 horas a 4 ° C em um tubo de rolo. Opcional: se Proteína A-Sepharose acopladas a esferas de IgGs não são directamente utilizados para o armazenamento de IP, para um máximo de uma semana é possível. Para isso, durante 60 segundos de centrifugação a 1.000 xg e 4 ° C para sedimentar as contas, remover cuidadosamente o superngrânulos atant e ressuspender em 5 ml de tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,5) contendo azida de sódio a 0,02% e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. 2. Preparação de Lise Celular reticulação, e Amostra Crescer duas culturas Chlamydomonas em meio contendo 7,5 mM de NH 4 Cl 14 ou 15 NH 4 Cl, como fonte de azoto, a uma densidade de 5 x 10 ~ 6 células / ml. As células precisam de passar por pelo menos 10 gerações para a rotulagem completa. Aqui, as células foram cultivadas em meio de TAP photomixotrophically 11 num agitador rotativo a 25 ° C sob irradiação contínua com luz branca (30 μE m -2 s -1). Transferir cada duas alíquotas de 14 N e 15-N-células marcadas para quatro tubos de colheita GSA e células através de uma centrifugação de 4 min a 4000 xg e 4 ° C (o número de células colhidas em cada alíquota depende da concentração celular do alvo proteína e precisa ser determinado empirically com antecedência para que a proteína alvo é precipitado suficiente. Um bom ponto de partida é de 10 células por aliquota 9, isto é, 200 ml de uma cultura com 5 x 10 6 células / ml.) Para a reticulação, apenas: no caso de complexos de proteínas irá ser reticulada antes de IP, as células têm de ser lavadas para remover as aminas presentes no meio. Para isso, Ressuspender as células em 40 ml de pré-arrefecido KH tampão (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM de KCl) e transferi-los para tubos Falcon de 50 ml. Centrifugue durante 60 segundos a 1000 xg e 4 ° C. Repetir esta etapa de uma só vez. Ressuspender as células em 2 ml de tampão de lise (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), MgCl2 1 mM, KCl 10 mM, NaCl 154 mM), pré-arrefecida a 4 ° C e os transferir para tubos de 15 ml Falcon. Recolher as células em tubos restantes GSA com um adicional de tampão de lise de 1 ml cada. Adicionar 50 ul de inibidor de protease de 25 x e 12,5 uL de 1 M de MgCl2 (para uma concentração final de 3,5 mM) para cada alíquota. Adicionar 150O tampão de lise ul, 12,5 ul de 1 M de ATP, 833 ul de 270 mM de fosfato de creatina e 7 5 ul de creatina fosfoquinase ug / uL (a concentração final é de 2,5 mM de ATP, 45 mM de fosfato de creatina, e 7 mg / ml de creatina-fosfoquinase) para um de as alíquotas contendo 14 N-e N-15 de células marcadas (que são o ATP + alíquotas). Adicionar 930 ul de tampão de lise, e 70 ul de 1 U / ul apirase para os outros alíquotas contendo 14 N-e N-15 de células marcadas (que são o-ATP alíquotas). Incubar durante 2 min a 25 ° C em um tubo de rolo para estabelecer-ATP e ATP esgotar-repletos estados. Se o passo de reticulação é omitido, adicionar outro 1 ml de tampão de lise. Para a reticulação, apenas: no caso de os investigadas interacções proteína-proteína são transitórios, é aconselhável capturá-los por uma etapa de reticulação. Por isso, adicionar 500 ul de 20 mM de ditio-bis-(succinimidil-propionato) (DSP) dissolvido em DMSO (concentração final é de 2 mM) a each tubo diretamente antes de sonicação. Sonicate quatro vezes de 20 segundos sobre o gelo para quebrar células com 20 seg pausas entre para refrigeração. (Nós usamos o Bandelin Sonoplus HD2070 com uma ponta KE76 no controle de saída de 75% e ciclo de trabalho de 60%. As configurações necessárias para outras máquinas / aparelhos / dicas precisam ser determinada com antecedência para garantir a lise celular completo e para evitar derramamento. ) Para a reticulação, apenas: permitir que os complexos de proteína de ligação transversal, por incubação durante 1 hora a 4 ° C em um tubo de rolo. Após a reticulação, completar cada tubo com 500 ul de 1 M de glicina, e incubar em um tubo de rolo durante mais 15 min a 4 ° C para extinguir reticulador livre. Prepare quatro almofadas de 6 ml de sacarose (20 mM de HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M de sacarose) em SW41 Ti tubos de parede fina (Beckman Coulter item No: 344059), cuidadosamente colocar toda a ~ 5,5 ml de lisados ​​celulares para a sacarose almofadas (equilíbrio com tampão de lise) e centrifuga-se durante 30 minutos a 200.000 xg e 4 ° C num SW41 Ti rotor. Transferir a parte superior do gradiente que contém os complexos proteicos solúveis em quatro tubos de 15 ml Falcon (evitar a transferência de partes da almofada de sacarose), adicionar 350 ul de Triton X-10% de 100 a uma concentração final de 0,5% para cada um deles, misturar cuidadosamente e adicionar tampão de lise, a um volume total de 7 ml cada. (Transferência de 70 ul de cada extracto celular solúvel para tubos frescos de 1,5 ml (Eppendorf tubos) e adicionar 70 ul de 2 x tampão de amostra SDS (SDS a 4%, 125 glicerol mM Tris-HCl (pH 6,8), 20%, 10 % de 2-mercaptoetanol) para cada um de SDS-PAGE e imunotransferência.) Descartar as almofadas de sacarose e ressuspender as peletes de membrana em 3 ml de tampão de lise a cada. Adicionar a cada 1 ml de 10% Triton X-100 até uma concentração final de 2%, sonicar em gelo para dissolver pelotas, e adicionar tampão de lise, a um volume total de 5 ml cada. Prepare mais quatro almofadas de 6 ml de sacarose em SW41 Ti tubos de parede fina, coloque o ~ 5 ml de membranas solubilizados de passo 2,10 com cuidado sobre a sacarosealmofadas, de centrifugação e durante 30 min a 200000 xg e 4 ° C num rotor Ti SW41. Transferir a parte superior do gradiente que contém complexos de proteína de membrana em quatro tubos de 15 ml Falcon e adicionar tampão de lise (contendo 2% de Triton X-100) para um volume final de 7 ml cada. (Transferir 70 uL de cada extracto celular solúvel de fresco tubos de Eppendorf e adicionar 70 uL de 2 x SDS-amostra de cada para SDS-PAGE e imunotransferência.) 3. Imunoprecipitação Pellet a Proteína A Sepharose grânulos contendo anticorpos acoplados (a partir de etapas de 1,8 ou 1,9) através de uma centrifugação de 60 segundos a 1000 xg e 4 ° C, cuidadosamente remover as pérolas do sobrenadante e ressuspender em 4 ml de tampão de lise. Repetir este passo duas vezes para equilibrar pérolas em tampão de lise. Perfaz-se com 8 ml de tampão de lise e transferir 1 ml da suspensão de cada um dos oito tubos de 15 ml Falcon contendo complexos de proteínas solúveis ou de membrana a partir de ATP e ATP repleto esgotam-14 </sse> N-15 N e marcada com células (a partir do passo 2.9 e 2.12). Incubar durante 2 horas a 4 ° C em um tubo de rolo para precipitar os complexos de proteínas. Pellet os grânulos por uma centrifugação de 60 segundos a 1000 xg e 4 ° C e os sobrenadantes descartar. Deixar um pequeno volume de líquido no topo das pérolas para facilitar a transferência. Transferir os grânulos de cada tubo Falcon para tubos cónicos de 1,5 ml (tubos Eppendorf). Para recolher todos os grânulos remanescentes nos tubos de Falcon, adicionar outro 0,8 ml de tampão de lise contendo 0,1% de Triton a cada um, vortex suavemente, durante 60 segundos de centrifugação a 1.000 xg e 4 ° C e transfira o tampão com os grânulos residuais para os tubos Eppendorf. Troca tubo é necessária para evitar a contaminação a partir de proteínas que aderem às paredes de plástico. Sedimentar as pérolas por uma centrifugação de 15 segundos a 16100 xg e 4 ° C, remover cuidadosamente os sobrenadantes e ressuspender em grânulos 1,3 ml de tampão de lise contendo 0,1% de Triton. Repetir este passo duas vezes com buf lisefer contendo Triton e duas vezes com tampão de Lise Triton falta para lavar as contas. Deixar um pequeno volume de líquido no topo das pérolas para facilitar a transferência. Novamente transferir os grânulos para tubos frescos de 1,5 ml de Eppendorf para remover as proteínas que aderem às paredes de plástico. Lave os tubos antigos com 1 ml de tampão de Lise Triton falta e transferir todas as contas residuais para os tubos novos. Centrifugar durante 15 segundos a 16.100 xg e 4 ° C, remove-se os sobrenadantes com uma pipeta de primeira normal, em seguida, remover qualquer sobrenadante remanescente completamente com uma seringa Hamilton de 50 ul. 4. Preparação de amostras para nano-LC-MS/MS Adicionar 100 ul de tampão de eluição recentemente preparada (8 M ureia, 25 mM de NH 4 HCO 3) a cada tubo, utilize a 100 ul de tampão de eluição de lavar grânulos aderindo à seringa Hamilton e incubar durante 10 min num Thermomixer a 800 rpm e 65 ° C, e durante mais 20 min a 30 ° C. (A muito mais completaeluição das proteínas ligadas é obtida por eluição com 2% de SDS e subsequente precipitação com acetona a 80%.) Centrifugue durante 15 segundos a 16100 xg e 25 ° C. Transfira os sobrenadantes para tubos frescos, com uma seringa Hamilton de 50 ul. Adicionar 50 ul de tampão de eluição para as pérolas, utilize a 50 ul de tampão de eluição de lavar grânulos que adere a uma seringa Hamilton e repetir as etapas de incubação e centrifugação de 4,1 e 4,2, respectivamente. A piscina do eluatos respectivos. (Transferência de 30 ul dos eluatos para tubos Eppendorf fresco, adicionar 30 ul de 2 x tampão de amostra SDS-a para cada um SDS-PAGE e imunotransferência.) Combina-se o eluído a partir de precipitados de + /-ATP-tratado, 14 N e 15 N-rotulado e as proteínas solúveis da membrana como se segue: 120 ul 15 N / uL ATP + e 120 14 N /-ATP 120 ul 14 N / + ATP e 120 ul de 15 N /-ATP 120 ul 15 N / uL ATP + e 120 14 N /-ATP <Br /> 120 ul 14 N / + ATP e 120 ul de 15 N /-ATP Adicionar 1,5 uL recentemente preparada DTT 1 M para uma concentração final de 6,5 mM de cada uma das quatro combinações de reduzir ligações dissulfureto (incluindo aqueles em o agente de reticulação) e incubar durante 30 min a 25 ° C. Adicionar 10,5 ul preparada de fresco 0,6 M iodoacetamida a uma concentração final de 25 mM para carboxymethylate os tióis reduzidos e incubar durante 20 min a 25 ° C no escuro. Adicionar 256 ul de 40 mM de NH 4 HCO 3 e 4 ul de Lys-C (0,1 ug / uL), os tubos de vedação com parafilme e incubadas durante pelo menos 16 horas durante a noite em uma roda de rotação a 37 ° C. Adicionar 470 ul de 20 mM de NH 4 HCO 3, 10 ul de acetonitrilo a 100% (a uma concentração final de 1%) e 8 ul de esferas de tripsina, e incuba-se numa roda de rotação durante pelo menos 16 horas a 37 ° C. Centrifugar durante 5 minutos a 16100 xg e 4 ° C, os sobrenadantes e transferência de fresco de 2 ml banheira Eppendorfes. Lavar os tubos de idade, com 50 ul de 20 mM de NH 4 HCO 3, 0,5% de ácido acético e, em conjunto com os sobrenadantes em primeiro lugar. Para dessalinização, preparar caseiros C 18-StageTips cortando dois discos de Empore C 18 de material com uma agulha de seringa e colocando-os numa ponta de pipeta de 200 uL. Deste modo preparar quatro 200 ul de pontas. Furos para as tampas de quatro tubos Eppendorf de 2 ml e pontas de pastilhas. Condição prévia a C 18-StageTips com 50 ul da solução B (acetonitrilo a 80%, 0,5% de ácido acético). Centrifugar durante 3 min a 800 g e 25 ° C. Equilibre a C 18-StageTips com 100 ul da solução A (ácido acético a 0,5%, acetonitrilo a 2%). Centrifugar durante 3 min a 800 g e 25 ° C. Repetir esta etapa de uma só vez. Carregar 100 uL dos sobrenadantes a partir das digestões trípticas (4.9) sobre a 18-C StageTips e centrifugar durante 3 min a 800 g e 25 ° C. Repetir este procedimento até os sobrenadantes completas foram aplicadasas colunas. Lava-se a 18-C StageTips com 100 ul da solução A. Centrifugar durante 3 min a 800 g e 25 ° C. Repetir este passo duas vezes. Eluir peptídeos trípticos em um novo tubo Eppendorf de 1,5 ml com 50 ul da solução B. Centrifugar durante 3 min a 800 g e 25 ° C. Repetir esta etapa de uma só vez. Péptidos secos para acabamento, em uma velocidade vac. Opcional: selo tubos Eppendorf com parafilme e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Ressuspender os péptidos secos com 20 ul da solução A e incubar durante pelo menos 1 hora em gelo, interrompido por duas 15 min-incubações em um banho de ultra-sons. Centrifugar durante 20 minutos a 16100 xg e 4 ° C, e o sobrenadante para aplicar nano-LC-MS/MS. 5. Resultados representativos Como se mostra, de forma exemplar para os 14 extractos de células marcadas com N na Figura 2A, e HSP70B CGE1 são quase exclusivamente localizada na fracção solúvel, independentemente do estado de ATP. EmCF1β contraste, está localizada frações solúveis e de membrana enriquecida, como tesouras sonificação parte do mesmo a partir de membrana-CF localizado o, e, portanto, serve como controlo de carga para as duas fracções. Como mostrado na Figura 2B, uma quantidade similar de HSP70B foram precipitados com anticorpos anti-HSP70B a partir de 14 N-15 N e marcadas com extractos solúveis, independentemente do estado de ATP. Em contraste, apenas pouco HSP70B foi precipitado a partir de fracções de membrana com quantidades ligeiramente maiores provenientes de fracções de membrana com depleção de ATP, em comparação com as fracções de ATP repletas, portanto confirmando os resultados anteriores 9. Não CGE1 foi co-precipitada com HSP70B em ATP-repletos frações solúveis ou membrana, enquanto que grandes quantidades de CGE1 foram co-precipitados a partir de ATP com HSP70B depletados frações solúveis e pouco a partir de fracções com depleção de ATP de membranas. A interacção de CGE1 com HSP70B apenas no estado ADP é também observada noAnálise de EM: na Figura 3, os espectros representativos da HSP70B MS1 e CGE1 peptídeos de precipitados com o anti-soro gerado a partir de extractos de células HSP70B solúveis são mostrados. Na experiência apresentada na Figura 3A, foram precipitados a partir de misturas de N-14 marcadas extractos desprovidos de ATP e 15 N-marcado extractos contendo ATP. Embora a forma pesada e leve do péptido marcado HSP70B foram detectados em intensidades iguais, apenas a forma de luz com a identificação do péptido CGE1 (a partir de extractos de-ATP) foi encontrado. Na Figura 3B os mesmos péptidos a partir do precipitado anti-HSP70B derivado de misturas de extractos de células marcadas reciprocamente solúveis são mostrados. Por conseguinte, desta vez apenas a forma pesada do péptido marcado CGE1 (a partir de extractos de-ATP) foi detectado, enquanto que este foi novamente o caso de tanto a luz, e os péptidos pesados ​​HSP70B etiquetados. <strong> Figura 1. Experimentais de fluxo de trabalho. As células são marcadas metabolicamente com 14 N e 15 N durante pelo menos 10 gerações, colhidas e fornecidos com ou empobrecido a partir de ATP. Depois de os complexos de proteína de células de lise pode ser opcionalmente reticulado (X-link) com o DSP. As células lisadas são então separadas em solúvel (sol) de membrana e enriquecidas (Pel) fracções. Proteínas alvo (aqui HSP70B) e uma proteína de controlo (aqui CF1β) são imunoprecipitadas com anticorpos específicos acoplados à proteína A-Sepharose (esferas pretas). Após lavagem, as proteínas precipitadas são eluídos e directamente analisado por immunoblotting, ou os respectivos 14 e 15 N-N marcada com fracções em ATP +-ATP e estados são reunidas, digeridas e analisadas por nano-LC-MS/MS. No caso do exemplo mostrado aqui a fracção de 15 N-marcado foi descarregada a partir de ATP. Peptídeos em conformidade, o rácio de intensidades de pesados ​​rotulados (cores escuras) para iluminar rotulados (cores claras) a partir da proteína de controlo(CF1β), a proteína alvo (HSP70B) e não-especificamente ligadas contaminantes devem ser em torno de um, enquanto esta proporção deverá ser muito elevado para as proteínas especificamente interagem com a proteína alvo (CGE1). para ver figura maior . Figura 2. A análise de imunoprecipitação para a entrada HSP70B. Proteína total foi extraída de solúvel (Sol) e enriquecida de membrana (Pel) ou fracções de exaustão de ATP (ATP) ou suplementado com ATP e um sistema de regeneração de ATP (ATP +). 0,01% dos extractos de proteínas foram separadas num gel de 10% SDS-poliacrilamida, e os níveis de HSP70B CGE1 e proteínas em relação a CF1β controle de carga foram analisados ​​por imunotransf erência. B Análise dos imunoprecipitados. HSP70B foi imunoprecipitado a partir de 14 N-e15 N-marcado solúvel e de membrana de células enriquecida contendo extractos ou sem ATP. Proteínas correspondentes a 3,3% do imunoprecipitados foram separados num gel de 10% SDS-poliacrilamida e os níveis de HSP70B e CGE1 relação ao carregamento CF1β controle foram analisados ​​por imunotransf erência. para ver figura maior . Figura 3. Um espectro de massa de HSP70B representativas e CGE1 péptidos anti-HSP70B imunoprecipitados realizados em fracções mistas solúveis (14 N-ATP / 15 N + ATP). Espectros MS total de 14 N e 15 N rotulado peptídeos, correspondente ao ATP e + ATP estados, respectivamente, a partir de HSP70B e co-imunoprecipitadas CGE1 são mostrados. Ambos os peptídeos estão triplamente carregadas, o peptídeo HSP70B contém 22 átomos de azoto, o PEPT CGE1ide 19, correspondente a um deslocamento de massa de 7,33 e 6,33 m / z, respectivamente. B espectros de massa Representante da experiência recíproca (14 N + ATP / 15 N-ATP). Os espectros de MS completa dos mesmos 14 N e 15 N rotulado péptidos, aqui correspondentes ao ATP +-ATP e estados, respectivamente, a partir de HSP70B e co-imunoprecipitadas CGE1 são mostrados. para ver figura maior .