に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル¹⁵ Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

1。抗体吸着プロテイン120mgの15 mlコニカルチューブ（ファルコン）でセファロースを秤量。セファロースは、各免疫沈降（IP）のために必要とされる15mgのタンパク質として、この量は8 IPアドレスのために十分である。 5ミリリットル0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）を加え、4℃で30分のためのプロテインAセファロースうねりを聞かせて （ここからすべてのステップは、タンパク質の分解/複雑な解離を避けるために、ケラチンと氷の上での汚染を避けるために手袋を用いて実施される必要があることに注意してください。） 1,000×gでペレットと4℃の腫れプロテインAセファロースで60秒間遠心します。上清を慎重に除去し、5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）にビーズを再懸濁する。徹底的にビーズを洗浄するには、このステップを3回繰り返します。 最後の遠心分離工程の後、上清を除去し、リン酸緩衝液約0.5mlを残す。 0.9ミリリットル0.5 Mリン酸緩衝液（pH 7.4）を追加し、400μlの親和性は、制御タンパク質（ここでCF1β）に対する標的タンパク質（ここでHSP70B）に対する一次抗体（IPあたり50μl）を精製し、16μlの抗体。 5mlの全量ddH 2 Oで埋める。 （アフィニティー精製された抗体は、ナノLC-MS分析を妨害する非特異的IgGは、による汚染を低減するために使用されるべきであることに注意してください-プロトコルのためWillmundらを参照（2005）10CF1βはローディングコントロールとして析出し、選ばれました。それは豊富で、細胞溶解後、可溶性および膜画分に存在するからである。あるいは、夾雑タンパク質のレベルは不平等ローディングのために正規化するために使用されるかもしれません。） チューブローラ（CAT RM5W、36回転）で25℃で1時間のインキュベーションの間にタンパク質吸着のIgGへのセファロースビーズを許可します。 1,000×gでペレットと4℃のプロテインAセファロースビーズで60秒間遠心します。慎重に上清とrを削除5ミリリットルの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液（pH 9.0）でビーズをesuspend。徹底的に架橋剤をクエンチなるアミンを削除するには、この手順を3回繰り返します。 の25.9 mgを量り、新鮮な、固体dimethylpimelimidateおよび20mMの最終濃度を得るために、5ミリリットルの0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）に懸濁します。プロテインAセファロースビーズにこのソリューションを追加します。 IgGは、クロスリンクのチューブローラー上で25℃で30分間プロテインすることができます。 1,000×gで、4℃ペレットにビーズで60秒間遠心します。上清を慎重に除去し、フリー架橋剤をクエンチ5ミリリットルの1M Tris-HCl（pH7.5）にビーズを再懸濁する。一度この手順を繰り返し、25℃で2時間インキュベートし、4℃または12〜24時間℃のチューブローラー上。にオプション：IgGをセファロースビーズに結合が直接IPで使用されていないプロテイン場合、最大一週間のための記憶が可能です。このため、1,000 xgで4℃で60秒間遠心℃のビーズを沈殿、慎重supernを削除4℃で0.02％アジ化ナトリウムや店舗を含む5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）中で再懸濁したビーズatant℃でさらに使用するまでのC。 2。細胞溶解、架橋およびサンプルの調製 〜5×10 6細胞/ mlの密度に窒素源として7.5mMの14 NH 4 Clまたは15 NH 4 Clを含む培地で2クラミドモナスの文化を育てています。細胞が完全なラベリングのための少なくとも10世代を通過する必要があります。ここでは、セルは白色光を連続照射（30μEm -2 s -1で ）の下で25℃でロータリーシェーカー°Cの上のTAP媒体11にphotomixotrophically成長させた。 4000 xgで4℃（各アリコートのために採取し、細胞数、ターゲットの細胞濃度に依存で4分間の遠心分離により4 GSAのチューブや収穫のセルに2つのアリコート14の各N-および15 N標識した細胞を転送タンパク質とeを決定する必要がmpiricallyは、事前に十分な標的タンパク質が沈殿しているか確認します。良い出発点は、アリコートあたり10 9細胞、 すなわち 、5×10 6細胞/ mlで培養の200ミリリットルです。） 架橋のためにのみ：タンパク質複合体が前にIPに架橋された場合には、細胞が培地中に存在するアミンを除去するために洗浄する必要があります。この、40ミリリットル、あらかじめ冷却したKHの緩衝液（20mM HEPES-KOH（pH7.2）を、80mMのKCl）を再懸濁した細胞および50mlのファルコンチューブに移す。 1,000×gで、4℃で60秒間遠心します一度この手順を繰り返します。 2mlの溶解緩衝液中で細胞を懸濁液（20mMのHEPES-KOH（pH7.2）を、1mMのMgCl 2、10mMのKCl、154 mMのNaCl）4にプリ℃まで冷却し、15mlのファルコンチューブに移す。さらに1 mlの溶解バッファーそれぞれとGSAのチューブ内に残っている細胞を回収する。各アリコートに50μlの25×プロテアーゼ阻害剤および12.5μlの1 M MgCl 2を （3.5 mMの最終濃度）を追加します。 150を追加μlの溶解バッファー、12.5μlの1 MのATP、833μlの270 mMのクレアチンリン酸と7μlの5μg/μLのクレアチンホスホキナーゼ（最終濃度が2.5 mMのATP、45mMのクレアチンリン酸、および7μg/ mlのクレアチンホスホキナーゼである）のいずれかに14 N-および15 N標識細胞（これらは+ ATPアリコートアール）を含むアリコート。 14 N-および15 N標識細胞（これらは、ATPのアリコートアール）を含む他のアリコートに930μlの溶解緩衝液および70μlの1 U /μlのアピラーゼを追加します。 25℃で2分間インキュベートし、チューブのATP枯渇を確立するためのローラーとATP充満状態でCを。架橋工程が省略された場合は、溶解緩衝液の別の1ミリリットルを追加します。 架橋の場合のみ：調査、タンパク質-タンパク質相互作用は一過性である場合、それは架橋工程によってそれらをキャプチャすることをお勧めします。このため、eにDMSOに溶解し500μlの20mMのジチオ – ビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）を（最終濃度が2 mMである）を追加直接超音波処理前のachチューブ。 冷却のための間に20秒の休憩を用いて細胞を壊すために氷の上に4回20秒を超音波洗浄します。 （私たちは75％と60％のデューティ·サイクルの出力制御でKE76先端でBandelin Sonoplus HD2070を使用しています。他のマシン/デバイス/ヒントのために必要な設定が完了し、細胞溶解を確実にし、こぼれを避けるために事前に決定する必要があります。 ） 架橋の場合のみ：4℃で1時間インキュベート℃をチューブローラー上でのタンパク質複合体をクロスリンクすることができます。架橋後、℃フリー架橋剤をクエンチするために4℃でさらに15分間チューブローラに500μlの1 Mグリシンとインキュベートして、各チューブを補う。 SW41 Ti薄膜壁管（ベックマン·コールター社商品番号：344059）の4つの6ミリリットルのスクロースクッション（20mMのHEPES-KOH（pH7.2）中、0.6 Mショ糖）を用意し、慎重に全体のレイ〜細胞溶解物の5.5 mlをショ糖にクッション（溶解バッファーとのバランス）と3020万xgでminと4℃SW41 Tiのロトで遠心R。 4を15mlファルコンチューブ（ショ糖クッションの部分を転送避ける）に水溶性のタンパク質複合体を含有する勾配の上部を移し、それらのそれぞれに0.5％の最終濃度になるように350μlの10パーセントのトリトンX-100を追加して、慎重に混ぜるそして7ミリリットルそれぞれ全量を溶解バッファーを追加します。 （新鮮な1.5 mlコニカルチューブ（エッペンドルフチューブ）への振替各可溶性細胞抽出液の70μlと70μlの2×SDSサンプルバッファー（4％SDS、125mMのトリス-HCl（pH 6.8）、20％グリセロール、10追加％2 -メルカプトエタノール）をSDS-PAGEおよびイムノブロット解析のための各々に。） ショ糖クッションを捨て、3 mlの溶解バッファーごとに膜ペレットを再懸濁します。 2％の最終濃度になるように各1mlの10％トリトンX-100に追加して、ペレットを溶解するために氷上で超音波処理し、それぞれ5mlの全量を溶解バッファーを追加します。 SW41 Ti薄膜壁管の別の4つの6ミリリットルのスクロースクッションを準備し、ショ糖に慎重にステップ2.10から可溶化された膜の〜5ミリリットルを築く20万xgで4℃SW41のTiローター中で30分間クッション、遠心分離する。 4を15mlファルコンチューブに膜タンパク質複合体を含有する勾配の上部を移し、 新鮮に 7ミリリットルそれぞれの最終容量（転送各可溶性細胞抽出液の70μlに溶解バッファー（2％Triton X-100を含む）を追加エッペンドルフチューブとSDS-PAGEおよびイムノブロット解析のためにそれぞれに70μlの2×SDSサンプルを追加します。） 3。免疫沈降ペレットプロテイン60秒1,000×gで遠心分離後、4結合した抗体（ステップ1.8または1.9から）を含むセファロースビーズ℃、慎重に4 mlの溶解緩衝液中に再懸濁したビーズ上清を除去します。溶解バッファーでビーズを平衡化するために二度、この手順を繰り返します。 溶解緩衝液で8ミリリットルに埋めると8 ATP-満ちから可溶性または膜タンパク質複合体を含む15mlのファルコンチューブおよびATP枯渇14のそれぞれに懸濁液1mlを転送</sアップ> N-および15 N標識細胞（ステップ2.9および2.12から）。 沈殿タンパク質複合体にチューブローラー上で4℃で2時間インキュベートします。 ペレットを1,000×gで60秒間遠心分離によりビーズや4℃、上清を捨てる。転送を容易にするためにビーズの上に少量の液体のままにしておきます。 各ファルコンチューブから1.5 mlコニカルチューブ（エッペンドルフチュー​​ブ）にビーズを転送します。 、ファルコンチューブに残っている全てのビーズを収集し、それぞれに0.1％のトリトンを含む別の0.8 mlの溶解バッファーを加え、穏やかにボルテックスし、1,000×gで60秒間遠心し、4℃、エッペンドルフチュー​​ブに残留ビーズを使用してバッファを転送します。チューブ交換は、プラスチックの壁に付着したタンパク質からの汚染を防止することが必要である。 16100 xgで4℃で15秒間の遠心分離によってペレットビーズ℃、慎重に0.1％のトリトンを含む1.3ミリリットルの溶解緩衝液で再懸濁し、ビーズ上清を除去します。溶解bufで二回、この手順を繰り返しトリトンを含むFERと二回徹底的にビーズを洗浄するためにトリトンを欠いた溶解緩衝液で。転送を容易にするためにビーズの上に少量の液体のままにしておきます。 再びプラスチックの壁に付着しているタンパク質を除去するために新しい1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブにビーズを転送します。トリトンを欠いた1mlの溶解緩衝液で古い管を洗浄し、新鮮なチューブにすべての残留ビーズを転送します。 16100×gで15秒間遠心し、4℃、通常のピペットを持つ最初の上清を除去し、次に50μlのハミルトンシリンジを用いて完全に残った上清を除去する。 4。 nano-LC-MS/MSのためのサンプル調製 、各チューブに100μlの調製したてのフレッシュな溶出バッファー（8M尿素、25mMのNH 4 HCO 3）を追加し 、800rpmでサーモミキサーで10分間ハミルトンシリンジとインキュベートに付着ビーズを洗い落とすために、100μlの溶出バッファーを使用し、 65℃、30℃でさらに20分間℃（より完全な結合したタンパク質の溶出は80％アセトンで2％SDSおよびその後の降水量と溶出することによって達成される。） 16100 xgで25℃で15秒間遠心します50μlのハミルトンシリンジで新鮮なチューブに上清を移してください。 ビーズに50μlの溶出バッファーを追加し、ハミルトンシリンジに付着したビーズを洗い流し、それぞれインキュベーション及び遠心分離手順4.1と4.2を繰り返すために、50μlの溶出緩衝液を使用しています。それぞれの溶出液をプール。 （新鮮なエッペンドルフチューブに溶出液の譲渡を30μl、SDS-PAGEおよびイムノブロット解析のためにそれぞれに30μlの2×SDSサンプルバッファーを加える。） 溶出されたが+ /-ATP処理から沈殿コンバイン、14のN、15 N標識次のように可溶性および膜タンパク質を： 120μlの15N / + ATPおよび120μlの14 N / A-ATP 120μlの14 N / A + ATPおよび120μlの15 N / A-ATP 120μlの15N / + ATPおよび120μlの14 N / A-ATP <BR /> 120μlの14 N / A + ATPおよび120μlの15 N / A-ATP ジスルフィド結合を還元（架橋剤中のものを含む）と25℃で30分間インキュベートする4つの組み合わせのそれぞれに6.5 mMの最終濃度を1.5μlの調製したてのフレッシュな1 MのDTTを追加℃に減少チオールをcarboxymethylate、25℃で20分間℃の暗所におけるCインキュベートする25mMの最終濃度に10.5μlの調製したてのフレッシュな0.6Mのヨードアセトアミドを追加します。 256μlの40mMのNH 4 HCO 3、4μlののLys-C（0.1μg/μLの）、パラフィルムでシールチューブ、そして37℃で回転ホイール上で一晩、少なくとも16時間インキュベート℃を追加 470μlの20mMのNH 4 HCO 3、10μlの100％アセトニトリル（1％の最終濃度まで）と8μlのトリプシンビーズを追加し、37℃で少なくとも16時間ローテーションホイールでインキュベート℃、 16100×gで5分間、4℃、転送清に新鮮な2mlのエッペンドルフ浴槽、遠心しますES。 50μlの20mMのNH 4 HCO 3、0.5％酢酸、最初の上清を持つプールで古い管を洗浄します。 脱塩のために、注射器の針でEmpore C 18の材料から2枚のディスクを切り出し、200μlのピペットチップにそれらを置くことによってC 18 StageTips自家製準備。このように4 200μlのヒントが用意します。パンチ4 2mlのエッペンドルフチュー​​ブとインサートチップの蓋に穴を開けます。 50μlの溶液B（80％アセトニトリル、0.5％酢酸）と前提条件C 18 StageTips。 800グラム、25℃で3分間遠心 100μlの溶液（0.5％酢酸、2％アセトニトリル）でC 18 StageTipsを平衡化します。 800グラム、25℃で3分間遠心一度この手順を繰り返します。 800グラム、25℃で3分間C 18 StageTipsと遠心分離機でトリプシン消化物（4.9）からの上清100μlを読み込む完全な上清が適用されるまで、この手順を繰り返し列。 800グラム、25℃で3分間、100μlの溶液A遠心機でC 18 StageTipsを洗う二回、この手順を繰り返します。 800グラムで3分間、25℃で50μlの溶液Bの遠心分離機で新しい1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブにトリプシンペプチドを溶出一度この手順を繰り返します。スピードバックで完了まで乾燥ペプチド。 オプション：使用するまで-80℃でパラフィルムや店舗°Cのシールエッペンドルフチュー​​ブ。 20μlのソリューションを用いて乾燥したペプチドを再懸濁し、超音波槽中で2つの15分のインキュベーションによって中断された氷の上に少なくとも1時間、インキュベートする。 16100 xgで4℃で20分間遠心し、上清nano-LC-MS/MSに適用されます。 5。代表的な結果 図2A、HSP70BとCGE1の14 N標識細胞抽出物をほぼ独占的に可溶性画分に局在しているためのようにATPの状態とは無関係に、例示的に示す。で超音波処理は、膜に位置するCF oから、それの一部をハサミ、したがって、両方の画分のローディングコントロールとしての役割を果たすコントラスト、CF1βは、可溶性及び膜濃縮画分に局在している。 図2bに示すように、HSP70B同様の金額が14、N-15とATPの状態とは無関係にN標識可溶性抽出物から抗HSP70B抗体で沈殿させた。これとは対照的に、少しだけHSP70Bが故に以前の結果を裏付ける9、ATP満ちた画分に比べて若干大きい金額は、ATP枯渇膜画分に由来すると膜画分から沈殿させた。 CGE1大量のATPが枯渇した可溶性画分からHSP70Bとともに共沈し、ATPが枯渇した膜画分から少しいた間は、CGE1は、ATP満ち可溶性または膜画分にHSP70Bとともに共沈されませんでした。 唯一のADP状態でHSP70B CGE1との相互作用はまたで観察されるMS分析： 図3、代表HSP70BのMS1スペクトルおよび可溶性細胞抽出物からHSP70Bの抗血清を用いて生成された沈殿物からCGE1ペプチドに示されている。沈殿、 図3Aに示すように実験ではATPとATPを含む15 N標識抽出を欠いた14 N標識の抽出物の混合物からのものであった。 HSP70Bペプチドの重鎖および軽標識体が等しい強度で検出されたものの、CGE1ペプチドの光のみが標識されたフォームは、（339-ATP抽出物）が判明した。 図3Bに往復標識した可溶性細胞抽出物の混合物由来の抗HSP70B沈殿物から同一のペプチドが示されています。これは再び、軽いものと重いというラベルの付いたHSP70Bペプチドの両方のケースだったしつつ、この時間は、わずかCGE1ペプチド（339-ATP抽出物）の重標識されたフォームは、検出された。 <強い>図1。実験のワークフロー。細胞は代謝的に、少なくとも10世代にわたって14 Nおよび15 Nで標識を回収し、付属またはATPから枯渇している。細胞溶解後のタンパク質複合体は、必要に応じてDSPと（Xリンク）架橋することができる。溶解された細胞は、その後、（ソル）可溶性および膜濃縮（PEL）の画分に分離されています。標的タンパク質（ここHSP70B）と制御タンパク質（ここCF1β）プロテインAセファロースビーズ（黒）に結合された特異的な抗体を用いて免疫沈降されています。洗浄した後、沈殿したタンパク質を溶出し、直接的にイムノブロットにより分析したり、それぞれの14 N-と+ ATPおよび-ATP状態の15 N標識フラクションをnano-LC-MS/MSによって、プールされた消化され、分析されます。例の場合、15 N標識フラクションはATPから枯渇したここに示されている。制御タンパク質から従って、光に重い標識（暗い色）の強度の比（光色）標識ペプチドこの比率は、具体的に標的タンパク質（CGE1）と相互作用するタンパク質を非常に高くなることが期待されている間（CF1β）、標的タンパク質（HSP70B）と非特異的に結合した汚染物質は、1前後となるはずです。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図2。 HSP70B免疫沈降のための入力の解析総タンパク質は可溶性（SOL）と膜濃縮（PEL）のいずれかのATP（-ATP）から枯渇やATPおよびATP再生系（+ ATP）を補充した画分から抽出した。タンパク質抽出物の0.01％を10％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離し、HSP70Bおよびロード制御CF1βに対する相対CGE1タンパク質のレベルはイムノブロッティングによって分析した。 免疫沈降のB分析。HSP70Bが14から免疫沈降し、N-としましたATPを含有する又はこれを欠く15 N標識可溶性および膜富化細胞抽出。免疫沈降物を10％SDS-ポリアクリルアミドゲルとHSP70Bと制御CF1βをロードするCGE1相対のレベルで分離したの3.3％に相当するタンパク質は、免疫ブロット法により分析した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図3。抗HSP70BからHSP70BとCGE1ペプチドの代表的な質量スペクトルは、14 Nおよび-ATPと+に対応した15 N標識ペプチドの混合可溶性画分（14 N-ATP / 15 N + ATP）で実施。フルMSスペクトルを免疫沈降 HSP70Bと共免疫沈降CGE1からそれぞれのATPの状態は、示されている。両方のペプチドは三重に充電され、HSP70Bペプチドは、22個の窒素原子、CGE1 PEPTが含まれていますIDE 19は、それぞれ7.33と6.33メートル/ zの質量シフトに対応する。B描写質量スペクトル相互実験（14 N + ATP / 15 N-ATP）から 。 + ATP-ATPとHSP70Bと共免疫沈降CGE1からそれぞれの状態、、に対応するここでは、同じ14 Nおよび15 N標識ペプチドの完全なMSスペクトルが示されています拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。