Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van¹⁵ N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

1. Antilichamencoatings Weeg 120 mg Protein A Sepharose in een 15 ml conische buis (Falcon). 15 mg proteïne A sepharose nodig voor elke immunoprecipitatie (IP) Deze hoeveelheid is voldoende voor 8 IP. Voeg 5 ml 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) en laat de Protein A Sepharose zwellen gedurende 30 min bij 4 ° C. (Alle stappen van dit punt moeten worden uitgevoerd met handschoenen verontreiniging met keratine en op ijs voorkomen eiwitafbraak / complex dissociatie vermijden.) Centrifugeer gedurende 60 sec bij 1.000 xg en 4 ° C tot pellet de gezwollen Protein A Sepharose. Verwijder het supernatant en resuspendeer de beads in 5 ml 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4). Herhaal deze stap drie keer om grondig te wassen de kralen. Na de laatste centrifugatiestap, verwijder supernatant en laat ongeveer 0,5 ml fosfaatbuffer. Voeg 0,9 ml 0,5 M fosfaatbuffer (pH 7,4), 400ul affiniteit gezuiverde primaire antilichamen (50 ul per IP) tegen het doeleiwit (hier HSP70B) en 16 pi antilichamen tegen een controle-eiwit (hier CF1β). Aanvullen met ddH 2 O tot een totaal volume van 5 ml. (Merk op dat affiniteitsgezuiverde antilichamen worden gebruikt ter beperking van verontreiniging door niet-specifieke IgG, die interfereren met nano-LC-MS analyse – een geschikte protocol Willmund et al. (2005) 10 CF1β neerslaat als een laad controle en werd gekozen.. omdat het overvloedig en na cellysis, aanwezig in oplosbare en membraanfracties. alternatief niveaus van verontreinigende eiwitten worden gebruikt om te normaliseren voor ongelijke belasting.) Toestaan ​​Protein A Sepharose kralen adsorberen IgGs gedurende 1 uur incubatie bij 25 ° C op een buis roller (CAT RM5W, 36 rpm). Centrifugeer gedurende 60 sec bij 1.000 xg en 4 ° C tot pellet de Protein A Sepharose kralen. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspend de kralen in 5 ml 0,1 M natriumboraatbuffer (pH 9,0). Herhaal deze stap drie keer voor grondige verwijdering van amines dat de crosslinker zou doven. Weeg 25,9 mg verse, vaste dimethylpimelimidate en in 5 ml 0,1 M natriumboraatbuffer (pH 9,0) mengen tot een eindconcentratie van 20 mM te verkrijgen. Voeg deze oplossing toe aan de Proteïne A Sepharose kralen. Toestaan ​​IgGs te verknopen aan Proteïne A gedurende 30 min bij 25 ° C op een buis roller. Centrifugeer gedurende 60 sec bij 1.000 xg en 4 ° C tot pellet de korrels. Verwijder het supernatant en resuspendeer de beads in 5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5) vrij crosslinker blussen. Herhaal deze stap eenmaal en incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C of 12-24 uur bij 4 ° C op een buis roller. Optioneel: indien Proteïne A Sepharose kralen gekoppeld aan IgG's worden niet direct gebruikt voor IP, opslag voor maximaal een week is mogelijk. Hiervoor centrifuge gedurende 60 seconden bij 1.000 xg en 4 ° C tot pellet de korrels, verwijder de supernatant en resuspendeer kralen in 5 ml 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,5) die 0,02% natriumazide en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. 2. Cel Lysis, verknoping en Monstervoorbereiding Groeien twee Chlamydomonas kweken in medium met 7,5 mM 14 NH 4 Cl of 15 NH 4 Cl als stikstofbron tot een dichtheid van ~ 5 x 10 6 cellen / ml. Cellen moeten doorlopen van ten minste tien generaties voor volledige etikettering. Hier werden cellen gekweekt in photomixotrophically TAP medium 11 op een roterende schudinrichting bij 25 ° C onder continue bestraling met wit licht (30 μE m-2s-1). Breng twee porties van elk 14 N-en 15 N-gemerkte cellen vier GSA buizen en oogsten cellen door een 4-min centrifugatie bij 4.000 xg en 4 ° C (het aantal cellen geoogst voor elk aliquot afhankelijk van de cellulaire concentratie van de target eiwit en moet worden bepaald empirically vooraf te waarborgen dat voldoende doeleiwit neerslaat. Een goed startpunt is 10 9 cellen per monster, dat wil zeggen, 200 ml van een cultuur met 5 x 10 6 cellen / ml.) Alleen voor crosslinking: in geval eiwitcomplexen voorafgaand aan IP worden verknoopt, cellen moeten worden gewassen om amines aanwezig in het medium te verwijderen. Hiervoor Resuspendeer cellen in 40 ml voorgekoeld KH buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM KCl) en overbrengen naar 50 ml Falcon tubes. Centrifugeer gedurende 60 sec bij 1.000 xg en 4 ° C. Eenmaal Herhaal deze stap. Resuspendeer cellen in 2 ml Lysis buffer (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM MgCl2, 10 mM KCl, 154 mM NaCl) voorgekoeld tot 4 ° C en overbrengen naar 15 ml Falcon tubes. Verzamel resterende cellen in GSA buizen met een extra 1 ml lysisbuffer elk. Voeg 50 ul 25 x protease inhibitor en 12,5 ul 1 M MgCl2 (tot een eindconcentratie van 3,5 mM) aan elk aliquot. Voeg 150ul lysisbuffer, 12,5 ul 1 M ATP, 833 ui 270 mM creatinefosfaat en 7 pl 5 ug / ul creatinefosfokinase (de uiteindelijke concentratie van 2,5 mM ATP, 45 mM creatinefosfaat en 7 ug / ml creatinefosfokinase) een van de fracties met 14 en 15 N-N-gelabelde cellen (dit zijn de ATP + aliquots). Voeg 930 ul lysisbuffer en 70 ul 1 U / ul apyrase de andere monsters met 14 en 15 N-N-gelabelde cellen (dit zijn de ATP-hoeveelheden). Incubeer gedurende 2 minuten bij 25 ° C op een buis roller te stellen ATP afbreken en ATP-vol-land. Als de verknopingsstap wordt weggelaten, nog een 1 ml Lysis buffer. Alleen voor crosslinking: indien de onderzochte eiwit-eiwit interacties transient is het raadzaam ze vast door een verknopingsstap. Hiervoor voeg 500 ul 20 mM dithio-bis (succinimidylpropionaat) (DSP) opgelost in DMSO (eindconcentratie is 2 mM) tot each buis direct voor ultrasoonapparaat. Sonificeer vier keer 20 seconden op ijs om cellen te breken met 20-sec pauzes tussen voor koeling. (We gebruiken de Bandelin Sonoplus HD2070 met een KE76 tip aan de uitgang van de controle van 75% en duty cycle van 60%. De noodzakelijke instellingen voor andere machines / apparaten / tips moeten vooraf worden bepaald om volledige cellyse te waarborgen en om te voorkomen dat morsen. ) Alleen voor crosslinking: eiwitcomplexen naar dwarskoppeling mogelijk door het incuberen gedurende 1 uur bij 4 ° C op een buis roller. Na verknoping vullen elke buis met 500 ul 1 M glycine en incubeer op een buis roller nog 15 min bij 4 ° C vrij crosslinker blussen. Bereid vier 6-ml sucrose kussens (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M sucrose) in SW41 Ti dunne buizen (Beckman Coulter Item nr.: 344059), Leg het gehele ~ 5,5 ml van cellysaten op de sucrose kussens (evenwicht met lysisbuffer) en gecentrifugeerd gedurende 30 min bij 200.000 xg en 4 ° C in een SW41 Ti rotor. Breng de top van de gradiënt die oplosbare eiwitcomplexen in vier 15 ml Falcon buizen (vermijden dat delen van het sucrosekussen), 350 ui 10% Triton X-100 toe tot een eindconcentratie van 0,5% aan elk van hen, meng en voeg Lysis buffer tot een totaal volume van 7 ml elk. (Transfer 70 pi van elk oplosbaar celextract vers 1,5 ml conische buizen (Eppendorf buizen) en voeg 70 ul 2 x SDS-monsterbuffer (4% SDS, 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 20% glycerol, 10 % 2-mercaptoethanol) elk voor SDS-PAGE en immunoblot analyse.) Gooi de sucrose kussens en resuspendeer de membraan pellets in 3 ml lysisbuffer per stuk. In elk 1 ml 10% Triton X-100 tot een eindconcentratie van 2%, ultrasone trillingen op ijs pellets lossen en voeg Lysis buffer tot een totaal volume van 5 ml elk. Bereid eens vier 6-ml sucrose kussens in SW41 Ti dunne wand buizen, leg de ~ 5 ml opgelost membranen van stap 2,10 voorzichtig op het sucrosekussens, en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 200.000 xg en 4 ° C in een SW41 Ti rotor. Breng de top van de gradiënt met membraaneiwit complexen in vier 15 ml Falcon buizen en voeg Lysis buffer (bevattende 2% Triton X-100) tot een eindvolume van 7 ml elk. (Transfer 70 pi van elk oplosbaar celextract verse Eppendorf-buisjes en voeg 70 ul 2 x SDS-monster elk voor SDS-PAGE en immunoblot analyse.) 3. Immunoprecipitatie Pellet de Proteïne A Sepharose kralen die gekoppeld antilichamen (van stap 1,8 of 1,9) door een 60 sec centrifugatie bij 1.000 xg en 4 ° C voorzichtig het supernatant en resuspendeer parels te verwijderen in 4 ml Lysis buffer. Twee keer Herhaal deze stap om parels evenwicht in lysisbuffer. Vul tot 8 ml met lysisbuffer en breng 1 ml van de suspensie aan elk van de acht 15 ml Falcon buizen die oplosbare membraan of eiwitcomplexen van ATP-verzadigd en ATP-afbrekende 14 </sup> N-en 15 N-gemerkte cellen (uit stap 2.9 en 2.12). Incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C op een buis roller te precipiteren eiwitcomplexen. Pellet de korrels door 60 sec centrifugatie bij 1.000 xg en 4 ° C. Verwijder de supernatanten. Laat een kleine hoeveelheid vloeistof op de korrels te vergemakkelijken. Breng de parels van elk Falcon buis 1,5 ml conische buizen (Eppendorf buizen). Alle resterende korrels in de Falcon tubes verzamelen, nog een 0,8 ml lysisbuffer die 0,1% Triton elk, vortex zachtjes centrifuge gedurende 60 seconden bij 1.000 xg en 4 ° C en breng de buffer met resterende korrels aan het Eppendorf buizen. Tube uitwisseling noodzakelijk is om verontreinigingen te voorkomen eiwitten hecht aan de kunststof wanden. Pellet de kralen door een 15 sec centrifugatie bij 16100 xg en 4 ° C, verwijder het supernatant en resuspendeer kralen in 1,3 ml lysisbuffer die 0,1% Triton. Twee keer Herhaal deze stap met lysis buffer met Triton en twee keer met lysisbuffer ontbreekt Triton grondig te wassen de kralen. Laat een kleine hoeveelheid vloeistof op de korrels te vergemakkelijken. Opnieuw over de korrels vers 1,5 ml Eppendorf buisjes eiwitten hechten aan de kunststof bekleding verwijderen. Was de oude buizen met 1 ml lysisbuffer ontbreekt Triton en de overdracht van alle overblijvende kralen aan de verse buizen. Centrifugeer gedurende 15 sec bij 16.100 xg en 4 ° C, de supernatanten eerst met een normale pipet verwijderen en volledig alle resterende supernatant met 50 pl Hamilton spuit. 4. Monstervoorbereiding voor nano-LC-MS/MS Voeg 100 ul vers bereide elutiebuffer (8 M ureum, 25 mM NH 4 HCO 3) aan elke buis met de 100 ui elutiebuffer te wassen beads plakken aan de Hamilton spuit en incubeer gedurende 10 min in een Thermomixer bij 800 rpm en 65 ° C, en nog 20 minuten bij 30 ° C. (A veel volledigerelutie van gebonden eiwitten wordt bereikt door elutie met 2% SDS en vervolgens precipitatie met 80% aceton.) Centrifugeer gedurende 15 sec bij 16.100 xg en 25 ° C. Overdracht supernatanten verse buizen met een 50-ul Hamilton spuit. Voeg 50 ul elutiebuffer om de kralen, gebruik maken van de 50 ul elutiebuffer te wassen kralen vast te houden aan Hamilton spuit en incubatie en centrifugatie stappen 4.1 en 4.2 te herhalen, respectievelijk. Zwembad de respectieve eluaten. (Transfer 30 pi van de eluaten vers Eppendorf buizen, voeg 30 ul 2 x SDS-monsterbuffer elk voor SDS-PAGE en immunoblot analyse.) Combineer de geëlueerde precipitaten van + / ATP-behandelde, 14 N-en 15N gemerkt oplosbaar en membraaneiwitten als volgt: 120 ul 15 N / + ATP en 120 pi 14 N /-ATP 120 ul 14 N / + ATP en 120 pi 15 N /-ATP 120 ul 15 N / + ATP en 120 pi 14 N / ATP-<br /> 120 ul 14 N / + ATP en 120 pi 15 N /-ATP Voeg 1,5 ul vers bereide 1 M DTT tot een eindconcentratie van 6,5 mM elk van de vier combinaties om disulfidebindingen (waaronder in de crosslinker) te verminderen en gedurende 30 min incuberen bij 25 ° C. 10,5 ul vers bereide 0,6 M joodaceetamide tot een eindconcentratie van 25 mM aan de verminderde thiolen carboxymethylering en incubeer gedurende 20 minuten bij 25 ° C in het donker. Voeg 256 ul 40 mM NH 4 HCO 3 en 4 pi Lys-C (0,1 pg / pl), seal buizen met parafilm en ten minste gedurende 16 uur overnacht op een rotatie wiel bij 37 ° C. Voeg 470 ul 20 mM NH 4 HCO 3, 10 ul 100% acetonitril (tot een eindconcentratie van 1%) en 8 pi trypsine kralen en incubeer op een rotatie wiel ten minste 16 uur bij 37 ° C. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16100 xg en 4 ° C, en overdracht supernatanten verse 2 ml Eppendorf tubes. Was de oude buizen met 50 pi 20 mM NH 4 HCO 3, 0,5% azijnzuur en pool met eerste supernatanten. Voor het ontzouten, voor te bereiden zelfgemaakte C 18-StageTips door het uitsnijden van twee schijven van Empore C 18 materiaal met een injectienaald en ze te plaatsen in een 200-ul pipet tip. Op deze manier bereiden vier 200-ul tips. Maak gaatjes in de deksels van vier 2-ml Eppendorf buizen en insert tips. Voorwaarde de C 18-StageTips met 50 ul oplossing B (80% acetonitril, 0,5% azijnzuur). Centrifugeer gedurende 3 min bij 800 g en 25 ° C. Equilibreren de C 18-StageTips met 100 ul oplossing A (0,5% azijnzuur, 2% acetonitril). Centrifugeer gedurende 3 min bij 800 g en 25 ° C. Eenmaal Herhaal deze stap. Plaats 100 ui van de supernatanten van de tryptic digesties (4.9) op de C 18-StageTips en centrifugeer gedurende 3 min bij 800 g en 25 ° C. Herhaal deze stap totdat de volledige supernatanten werden toegepastde kolommen. Was de C 18-StageTips met 100 ul oplossing A Centrifuge gedurende 3 min bij 800 g en 25 ° C. Herhaal deze stap tweemaal. Tryptische peptiden elueren in een nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis met 50 ul oplossing B. Centrifuge gedurende 3 min bij 800 g en 25 ° C. Eenmaal Herhaal deze stap. Droge peptiden voltooid in een Speed ​​Vac. Optioneel: seal Eppendorf buizen met parafilm en bij -80 ° C tot verder gebruik. Resuspendeer de gedroogde peptiden met 20 ul oplossing A en ten minste gedurende 1 uur op ijs, onderbroken door twee 15 min incubatie in een sonicator bad. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.100 xg en 4 ° C en toepassing supernatant nano-LC-MS/MS. 5. Representatieve resultaten Zoals exemplarisch weergegeven voor de 14 N-gemerkte celextracten in figuur 2A, worden HSP70B en CGE1 bijna uitsluitend gelokaliseerd in de oplosbare fractie, onafhankelijk van de ATP staat. InDaarentegen CF1β is gelokaliseerd op oplosbare en membraan-verrijkte fracties, zoals sonicatie scharen deel uit membraan aanwezige CF o en dus dient als ladingcontrole voor beide fracties. Zoals getoond in figuur 2B, werden gelijke hoeveelheden HSP70B geprecipiteerd met anti-HSP70B antilichamen van 14 N-en 15N gemerkt oplosbare extracten, onafhankelijk van de ATP staat. Daarentegen werd slechts weinig HSP70B neergeslagen uit membraanfracties met iets grotere hoeveelheden afkomstig van ATP ontdane membraanfracties vergeleken met ATP vol fracties dus bevestigende eerdere resultaten 9. Geen CGE1 werd mede-geprecipiteerd met HSP70B in ATP-vol oplosbare of membraanfracties, terwijl grote hoeveelheden CGE1 werden samen geprecipiteerd met HSP70B van ATP-uitgeputte oplosbare fracties, en weinig van ATP-uitgeputte membraanfracties. De interactie van CGE1 met HSP70B alleen in de ADP staat wordt ook waargenomen in deMS analyse: in figuur 3 representatief MS1 spectra van HSP70B en CGE1 peptiden van precipitaten gegenereerd met HSP70B antiserum oplosbare celextracten getoond. In het experiment getoond in figuur 3A, precipitaten werden uit mengsels van 14 N-gemerkte extracten ontbreekt ATP en 15N gemerkt extracten die ATP. Terwijl de zware en lichte gelabelde vorm van het peptide HSP70B werden gedetecteerd op gelijke intensiteit, werd alleen het licht gelabelde vorm van het peptide CGE1 (van ATP-extracten) gevonden. In figuur 3B dezelfde peptiden van de anti-HSP70B neerslag uit mengsels van wederzijds oplosbare gemerkte celextracten getoond. Derhalve nu alleen de zware gelabelde vorm van het peptide CGE1 (van ATP-extracten) gedetecteerd, terwijl dit ook het geval voor zowel lichte als zware gemerkte peptiden HSP70B. <strong> Figuur 1. Experimental workflow. Cellen worden metabolisch gelabeld met 14 N en 15 N ten minste 10 generaties geoogst en met of verarmd van ATP. Na cellysis eiwitcomplexen eventueel kan zijn verknoopt (X-link) met DSP. Gelyseerde cellen worden vervolgens gescheiden in oplosbare (Sol) en membraan verrijkte (Pel) fracties. Doeleiwitten (hier HSP70B) en een controle-eiwit (hier CF1β) zijn immunologisch specifieke antilichamen gekoppeld aan proteïne A sepharose kralen (zwart). Na wassen worden neergeslagen eiwitten geëlueerd en hetzij rechtstreeks geanalyseerd door immunoblotting, of de respectieve 14 N-en 15N gemerkt fracties + ATP en ATP-staten samengevoegd, gedigereerd en geanalyseerd door nano-LC-MS/MS. In het voorbeeld hier getoonde geval 15N gemerkt fractie werd uitgeput van ATP. Derhalve is de verhouding van intensiteiten van zware gemerkte (donkere kleuren) aan licht gelabeld (lichte kleuren) peptiden van de controle-eiwit(CF1β), het doeleiwit (HSP70B) en niet-specifiek gebonden verontreinigingen moet ongeveer een terwijl deze verhouding waarschijnlijk zeer hoog specifiek eiwit interactie met het doeleiwit (CGE1). Klik hier om groter bedrag bekijken . Figuur 2. Een analyse van de input voor HSP70B immunoprecipitatie. Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit oplosbaar (Sol) en membraan verrijkte (Pel) ofwel verarmd fracties van ATP (-ATP) of aangevuld met ATP en ATP een regenererend systeem (+ ATP). 0,01% van het eiwit extracten werden gescheiden op een 10% SDS-polyacrylamide gel, en niveaus van HSP70B en CGE1 eiwit opzichte ladingcontrole CF1β werden geanalyseerd door immunoblotting. B Analyse van immunoprecipitaten. HSP70B werd immunologisch van 14 N-en15N gemerkt oplosbare en membraan-verrijkte celextracten met ATP of ontbreekt. Eiwitten overeenkomt met 3,3% van de immunoprecipitaten werden gescheiden op een 10% SDS-polyacrylamide gel en niveaus van HSP70B en CGE1 opzichte ladingcontrole CF1β werden geanalyseerd door immunoblotting. Klik hier om groter bedrag bekijken . Figuur 3. Een vertegenwoordiger massaspectra van HSP70B en CGE1 peptiden van anti-HSP70B uitgevoerd op immunoprecipitaten gemengde oplosbare fracties (14 N-ATP / 15 N + ATP). Volledige MS spectra van 14 N en 15 N gemerkte peptiden, die overeenkomen met de ATP-en + ATP staten respectievelijk van HSP70B en co-immuno CGE1 getoond. Beide peptiden worden drievoudig opgeladen, gaat het HSP70B peptide bevat 22 stikstofatomen, de CGE1 PEPTide 19, overeenkomend met een massaverschuiving van 7,33 en 6,33 m / z respectievelijk. Representatieve B massaspectra van de wederkerige experiment (14 N + ATP / 15 N-ATP). Volledige MS spectra van dezelfde 14 N en 15 N gemerkte peptiden, hier overeenkomen met de + ATP en ATP-toestanden respectievelijk van HSP70B en co-immuno CGE1 getoond. Klik hier om groter bedrag bekijken .