Un protocole pour l'identification des interactions protéine-protéine Basé sur¹⁵ N marquage métabolique, immunoprécipitation, la spectrométrie de masse quantitative et d'affinité de modulation

1. Anticorps adsorption Peser 120 mg de protéine A-Sepharose dans un tube de 15 ml conique (Falcon). De 15 mg Protéines A sépharose est nécessaire pour chaque immunoprécipitation (IP), ce montant est suffisant pour 8 IPs. Ajouter 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) et laissez la protéine A Sepharose houle pendant 30 min à 4 ° C. (Notez que toutes les étapes de ce point sur ​​doivent être effectuées avec des gants pour éviter la contamination de kératine et de la glace pour éviter la dégradation des protéines / complexe de dissociation.) Centrifuger pendant 60 s à 1.000 x g et 4 ° C pour sédimenter la protéine A-Sepharose gonflé. Retirez délicatement le surnageant et remettre en suspension les perles dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4). Répétez cette étape trois fois de se laver soigneusement les perles. Après la dernière étape de centrifugation, éliminer le surnageant et laisser environ 0,5 ml de tampon phosphate. Ajouter 0,9 ml de tampon phosphate 0,5 M (pH 7,4), 400ul affinité des anticorps purifiés primaires (50 pi par IP) contre la protéine cible (ici hsp70B), et 16 pl des anticorps dirigés contre une protéine de contrôle (ici CF1β). Remplir avec ddH 2 O pour un volume total de 5 ml. (Notez que purifiés par affinité des anticorps doit être utilisé pour réduire la contamination par les IgG non spécifiques, qui interfèrent avec la nano-LC-MS – pour un protocole de voir Willmund et al (2005) 10 CF1β est précipité sous forme d'un contrôle de chargement et a été choisi.. car elle est abondante et, après lyse des cellules, présente dans les fractions solubles et membranaires. En variante, les niveaux de protéines contaminantes peut être utilisée pour normaliser chargement inégal.) Permettez-protéine A billes de Sepharose IgG à adsorber au cours d'une incubation de 1 h à 25 ° C sur un rouleau de tube (CAT RM5W, 36 rpm). Centrifuger pendant 60 s à 1.000 x g et 4 ° C pour sédimenter la protéine A billes de Sepharose. Retirez délicatement le surnageant et resuspend les perles dans 5 ml de sodium 0,1 M tampon borate (pH 9,0). Répétez cette étape trois fois pour enlever complètement les amines qui éteignent l'agent de réticulation. Peser 25,9 mg de frais, solide et dimethylpimelimidate remettre en suspension dans 5 ml de tampon 0,1 M de borate de sodium (pH 9,0) pour obtenir une concentration finale de 20 mM. Ajouter cette solution à la protéine A Sepharose perles. Permettez-IgG de réticuler à la protéine A pendant 30 min à 25 ° C sur un rouleau de tube. Centrifuger pendant 60 s à 1.000 x g et 4 ° C pour sédimenter les billes. Retirez délicatement le surnageant et remettre en suspension les billes dans 5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,5) pour étancher réticulant libre. Répétez cette étape une fois et laisser incuber pendant 2 heures à 25 ° C ou 12-24 heures à 4 ° C sur un rouleau de tube. Facultatif: si la protéine A sépharose couplées à des billes IgG ne sont pas directement utilisés pour la propriété intellectuelle, le stockage d'une semaine est possible. Pour cela, centrifuger 60 sec à 1000 xg et 4 ° C pour sédimenter les billes, retirez délicatement le supernperles atant et remettre en suspension dans 5 ml de tampon phosphate 0,1 M (pH 7,5) contenant de l'azoture de sodium à 0,02% et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. 2. Préparation de lyse cellulaire, réticulation et de l'échantillon Pousser deux cultures dans un milieu contenant Chlamydomonas 7,5 mM 14 NH 4 Cl ou NH 4 Cl 15 en tant que source d'azote à une densité d'environ 5 x 10 6 cellules / ml. Les cellules ont besoin pour passer à travers au moins dix générations pour l'étiquetage complet. Ici, les cellules ont été cultivées dans 11 photomixotrophically milieu TAP sur un agitateur rotatif à 25 ° C sous irradiation continue avec la lumière blanche (30 pE m -2 s -1). Transférer deux aliquotes de chaque N-14 et N-15 des cellules marquées à quatre tubes GSA et la récolte des cellules par centrifugation un 4-mn à 4.000 x g et 4 ° C (Le nombre de cellules récoltées pour chaque aliquote dépend de la concentration cellulaire de la cible besoins en protéines et à déterminer empirically à l'avance pour faire en sorte que la protéine cible est précipité suffisant. Un bon point de départ est de 10 9 cellules par aliquote, à savoir, 200 ml d'une culture de 5 x 10 6 cellules / ml). Pour la reticulation uniquement: dans le cas des complexes protéiques seront réticulé avant IP, les cellules ont besoin d'être lavé pour éliminer les amines présentes dans le milieu. Pour ce faire, remettre les cellules dans 40 ml de tampon de pré-refroidi KH (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 80 mM de KCl) et de les transférer à tubes de 50 ml Falcon. Centrifuger pendant 60 s à 1.000 x g et 4 ° C. Répétez cette étape qu'une seule fois. Resuspendre les cellules dans 2 ml de tampon de lyse (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 1 mM de MgCl2, KCl 10 mM, 154 mM NaCl) pré-refroidi à 4 ° C et de les transférer à 15 ml tubes Falcon. Recueillir des cellules restantes dans des tubes GSA avec un supplément de 1 ml chacun tampon de lyse. Ajouter 50 ul 25 inhibiteur de la protéase et de 12,5 x pl 1 M de MgCl 2 (à une concentration finale de 3,5 mM) à chaque aliquote. Ajouter 150tampon de lyse ul, 12,5 ul ATP 1 M, 833 ul 270 mM phosphate de créatine et 7 pi 5 de la créatine phosphokinase pg / pl (la concentration finale est de 2,5 mM de créatine phosphokinase ATP, 45 mM de phosphate de créatine, et 7 pg / ml) à l'un des les aliquotes contenant 14 N et 15-N cellules marquées (ce sont les aliquotes + ATP). Ajouter 930 ul de tampon de lyse et 70 pi 1 U / ul apyrase aux autres aliquotes contenant 14 N et 15-N cellules marquées (ce sont les aliquotes-ATP). Incuber pendant 2 min à 25 ° C sur un rouleau de tube pour établir l'ATP épuiser et de l'ATP regorgent Etats. Si l'étape de réticulation est omis, ajouter un autre 1 ml de tampon de lyse. Pour la reticulation uniquement: dans le cas des enquêtes interactions protéine-protéine sont transitoires, il est conseillé de les capturer par une étape de réticulation. Pour cela, ajouter 500 ul 20 mM dithio-bis (succinimidyl propionate) (DSP) dissous dans du DMSO (concentration finale de 2 mM) à eTube ach directement avant sonication. Soniquer quatre fois 20 secondes sur la glace pour casser les cellules avec 20 sec pauses entre les deux pour le refroidissement. (Nous utilisons le Bandelin Sonoplus HD2070 avec une pointe KE76 au contrôle de la production de 75% et le rapport cyclique de 60%. Les réglages nécessaires pour d'autres machines / appareils / conseils doivent être déterminées à l'avance pour assurer une lyse cellulaire complète et pour éviter de renverser. ) Pour la reticulation seuls: autorise les complexes protéiques de réticuler par incubation pendant 1 h à 4 ° C sur un rouleau de tube. Après réticulation, de compléter chaque tube avec 500 ul de glycine 1 M et incuber sur un tube de rouleau pendant 15 min à 4 ° C pour étancher réticulant libre. Préparer quatre coussins de saccharose 6-ml (20 mM HEPES-KOH (pH 7,2), 0,6 M de saccharose) dans SW41 Ti mince paroi des tubes (Beckman Coulter No. d'article: 344059), appuyez avec soin l'ensemble de ~ 5,5 ml de lysats cellulaires sur le saccharose coussins (équilibre avec un tampon de lyse) et centrifuger pendant 30 min à 200.000 xg et à 4 ° C dans un roto SW41 Tir. Transférer le sommet du gradient contenant des complexes de protéines solubles dans quatre tubes Falcon de 15 ml (éviter de transférer des parties de l'coussin de saccharose), ajouter 350 ul de 10% de Triton X-100 à une concentration finale de 0,5% à chacun d'eux, mélanger soigneusement et ajouter un tampon de lyse dans un volume total de 7 ml chacun. (Transfert 70 ul de chaque extrait cellulaire soluble de frais de 1,5 ml tubes coniques (tubes Eppendorf) et ajouter 70 ul 2 x SDS-tampon d'échantillon (4% SDS, 125 mM de glycérol Tris-HCl (pH 6,8), 20%, 10 % de 2-mercaptoéthanol) à chacun pour SDS-PAGE et immunoblot analyses.) Jeter les coussins de saccharose et de remettre en suspension les culots de membranes dans 3 ml de chaque tampon de lyse. Ajouter à chaque 1 ml de Triton 10% X-100 à une concentration finale de 2%, une sonication sur de la glace pour dissoudre des pastilles, et ajouter un tampon de lyse dans un volume total de 5 ml chacun. Préparer quatre autres coussins de saccharose 6-ml dans des tubes SW41 Ti paroi mince, poser le ~ 5 ml de membranes solubilisées de l'étape 2.10 soigneusement sur le saccharosecoussins, et centrifuger pendant 30 min à 200.000 xg à 4 ° C dans un rotor SW41 Ti. Transférer le sommet du gradient contenant des complexes de protéines membranaires en quatre tubes Falcon de 15 ml et ajouter un tampon de lyse (contenant 2% de Triton X-100) à un volume final de 7 ml chacun. (Transfert 70 ul de chaque extrait cellulaire soluble de frais tubes Eppendorf et ajoutez 70 pi 2 x SDS-échantillon à chacun pour SDS-PAGE et immunoblot analyses.) 3. Immunoprécipitation Pellet de la protéine A billes de Sepharose contenant des anticorps couplés étapes (à partir de 1,8 ou 1,9) par une centrifugation de 60 sec à 1000 xg et à 4 ° C, retirer délicatement les perles surnageant et remettre en suspension dans 4 ml de tampon de lyse. Répétez cette étape deux fois pour équilibrer perles dans un tampon de lyse. Remplissez jusqu'à 8 ml avec du tampon de lyse et de transférer 1 ml de la suspension à chacun des huit tubes Falcon de 15 ml contenant des complexes de protéines solubles ou membranaires de l'ATP-remplie et ATP-14 épuiser </sup> N et 15 N-cellules marquées (de l'étape 2.9 et 2.12). Incuber pendant 2 heures à 4 ° C sur un tube de rouleau pour précipiter les complexes de protéines. Les perles de granulés par une centrifugation de 60 sec à 1000 xg et à 4 ° C et jeter le surnageant. Ajouter un petit volume de liquide sur le dessus des billes pour faciliter le transfert. Transférez les perles de chaque tube Falcon à 1,5 ml tubes coniques (tubes Eppendorf). À recueillir toutes les billes restantes dans les tubes Falcon, ajouter un autre tampon de lyse contenant 0,8 ml de Triton 0,1% à chacune vortex doucement, centrifuger pendant 60 s à 1.000 x g et 4 ° C et le tampon de transfert à billes résiduelles aux tubes Eppendorf. Tube d'échange est nécessaire pour éviter les contaminations de protéines adhérentes aux parois en plastique. Pellet des billes par une centrifugation de 15 sec à 16.100 xg et 4 ° C, retirez avec précaution le surnageant et remettre les billes en 1.3 ml tampon de lyse contenant 0,1% de Triton. Répétez cette étape deux fois avec buf lysefer contenant du Triton et deux fois avec un tampon de lyse Triton défaut de se laver les billes. Ajouter un petit volume de liquide sur le dessus des billes pour faciliter le transfert. Transférer à nouveau les billes de nouvelles 1,5-ml tubes Eppendorf pour éliminer les protéines qui adhèrent aux parois en plastique. Laver les vieux tubes avec 1 ml de tampon de lyse Triton défaut et transférer toutes les billes résiduelles pour les nouveaux tubes. Centrifuger pendant 15 sec à 16.100 xg et 4 ° C, retirez les surnageants abord avec une pipette normale, puis retirez toute surnageant restant complètement avec une seringue de 50 ul Hamilton. 4. Préparation d'échantillons pour nano-LC-MS/MS Ajouter 100 pi de tampon d'élution fraîchement préparé (8 M d'urée, 25 mM de NH 4 HCO 3) à chaque tube, utiliser le tampon de 100 ul élution à laver perles de coller à la seringue Hamilton et incuber pendant 10 min dans un thermomixer à 800 tours par minute et 65 ° C, et pendant encore 20 min à 30 ° C (A beaucoup plus complètel'élution des protéines liées s'effectue par élution avec précipitation subséquente de SDS et 2% avec de l'acétone à 80%.) Centrifuger pendant 15 sec à 16.100 xg et 25 ° C. Transfert surnageants de nouveaux tubes avec une seringue de 50 ul Hamilton. Ajouter 50 ul de tampon d'élution pour les perles, utiliser le tampon de 50 ul d'élution pour se laver de perles de coller à la seringue Hamilton et répétez les étapes d'incubation et centrifugation 4,1 et 4,2, respectivement. Mettre en commun les éluats respectifs. (Transfert 30 pi des éluats de frais tubes Eppendorf, ajouter 30 ul 2 x SDS-tampon d'échantillon à chacun pour SDS-PAGE et immunoblot analyses.) Combinez le éluée précipite à partir de + /-ATP-traitée, 14 N et 15 N-étiquetés protéines solubles et membranaires comme suit: 120 pi 15 N / + ATP et 120 pi 14 N / ATP- 120 pi 14 N / + ATP et 120 pi 15 N / ATP- 120 pi 15 N / + ATP et 120 pi 14 N / ATP-<br /> 120 pl 14 N / + ATP et 120 pi 15 N / ATP- Ajouter 1,5 ul fraîchement préparée DTT 1 M à une concentration finale de 6,5 mM de chacun des quatre combinaisons pour réduire les liaisons disulfures (y compris ceux de l'agent de réticulation) et incuber pendant 30 min à 25 ° C. Ajouter 10,5 ul fraîchement préparée 0,6 M iodoacétamide à une concentration finale de 25 mM à carboxyméthylate les thiols réduits et incuber pendant 20 min à 25 ° C dans l'obscurité. Ajouter 256 ul de 40 mM NH 4 HCO 3 et 4 pl Lys-C (0,1 pg / pl), des tubes joints avec du parafilm et incuber pendant au moins 16 heures durant la nuit sur ​​une roue de rotation à 37 ° C. Ajouter 470 ul 20 mM NH 4 HCO 3, 10 ul d'acétonitrile 100% (à une concentration finale de 1%) et la trypsine 8 perles ul, et incuber sur une roue de rotation pendant au moins 16 heures à 37 ° C. Centrifuger pendant 5 min à 16100 xg et 4 ° C, les surnageants de transfert et de frais de 2 ml Eppendorf baignoirees. Laver les vieux tubes avec 50 pl 20 mM NH 4 HCO 3, 0,5% d'acide acétique, et d'une piscine avec des surnageants d'abord. Pour le dessalage, la préparation faite maison C 18-StageTips en découpant deux disques de Empore C 18 matériau avec une aiguille de seringue et de les placer dans un embout de pipette 200-pi. De cette manière, préparer quatre 200-pi de conseils. Percez des trous dans le couvercle de quatre tubes Eppendorf de 2 ml et des conseils d'insertion. Condition de la C 18-StageTips avec 50 ul de solution B (80% d'acétonitrile, 0,5% d'acide acétique). Centrifuger 3 min à 800 g et 25 ° C. Équilibrer la C 18-StageTips avec 100 ul de solution A (acide acétique à 0,5%, 2% d'acétonitrile). Centrifuger 3 min à 800 g et 25 ° C. Répétez cette étape qu'une seule fois. Chargez 100 pl des surnageants des digestions tryptiques (4,9) sur la C 18-StageTips et centrifuger 3 min à 800 g et 25 ° C. Répétez cette étape jusqu'à ce que les surnageants complètes ont été appliquées àles colonnes. Laver le C 18-StageTips avec 100 Centrifugeuse Solution A. ul pendant 3 min à 800 g et 25 ° C. Répétez cette étape deux fois. Éluer peptides tryptiques dans un nouveau tube de 1,5 ml Eppendorf Centrifuge avec 50 B. Solution ul pendant 3 min à 800 g et 25 ° C. Répétez cette étape qu'une seule fois. Peptides secs à la fin d'un speed vac. En option: joint des tubes Eppendorf avec du parafilm et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Reprendre les peptides séchées avec 20 ul de solution A et incuber pendant au moins 1 heure sur la glace, interrompue par deux incubations de 15 minutes dans un bain d'ultrasons. Centrifuger pendant 20 minutes à 16.100 xg et 4 ° C, et d'appliquer le surnageant dans nano-LC-MS/MS. 5. Les résultats représentatifs Comme le montre exemplairement pour les 14 extraits de cellules N-marqués dans la figure 2A, hsp70B et CGE1 sont presque exclusivement localisée dans la fraction soluble, indépendante de l'état ATP. Enrevanche, CF1β est localisée dans les fractions solubles et membranaires enrichis, comme la sonication cisaille partie de membrane située o CF, et sert donc de contrôle du chargement pour les deux fractions. Comme le montre la figure 2B, des quantités similaires de hsp70B ont été précipités avec les anticorps anti-hsp70B de 14 N et 15 N-marquées extraits solubles, indépendamment de l'état de l'ATP. En revanche, seulement hsp70B peu a été précipité à partir de fractions membranaires avec des quantités légèrement plus importantes provenant de fractions membranaires ATP appauvries par rapport aux fractions ATP regorgent donc confirmer les résultats précédents 9. Aucune CGE1 a été co-précipité avec de l'ATP-hsp70B regorgent fractions solubles ou membranaires, alors que de grandes quantités de CGE1 ont été co-précipité avec de l'ATP hsp70B appauvries fractions solubles et peu de fractions membranaires ATP appauvries. L'interaction de CGE1 avec hsp70B seulement dans l'état ADP est également observée dans laAnalyse MS: la figure 3, représentant des spectres MS1 hsp70B et CGE1 peptides générés à partir des précipités avec l'antisérum hsp70B partir d'extraits cellulaires solubles sont affichés. Dans l'expérience présentée sur la figure 3A, les précipités ont été à partir de mélanges de 14 N-étiquetés extraits dépourvus de l'ATP et 15 N-étiquetés contenant des extraits de l'ATP. Bien que la forme lourde et légère marquée du peptide hsp70B ont été détectés à des intensités égales, seule la forme la lumière du peptide étiqueté CGE1 (de-ATP extraits) a été trouvé. La figure 3B les mêmes peptides du précipité anti-hsp70B dérivés de mélanges d'extraits cellulaires marqués mutuellement solubles sont affichés. Par conséquent, cette fois seulement la forme lourde étiquette du peptide CGE1 (de-ATP extraits) a été détectée, ce fut encore le cas pour les deux, légers et lourds peptides hsp70B étiquetés. <strong> Figure 1. Expérimentales de flux de travail. Cellules sont marquées métaboliquement avec 14 N et 15 N pendant au moins 10 générations, récoltées et livrées avec ou appauvri à partir d'ATP. Après lyse des cellules complexes de protéines peut être éventuellement réticulé (X-link) avec DSP. Cellules lysées sont ensuite séparés sous forme soluble (Sol) et la membrane enrichis (Pel) fractions. Protéines cibles (ici hsp70B) et une protéine de contrôle (ici CF1β) sont immunoprécipités avec des anticorps spécifiques couplés à la protéine A billes de sépharose (noir). Après le lavage, les protéines précipitées sont élues et directement analysées par immunoblot, ou les 14 respectifs N et 15 N-marqué dans les fractions + ATP-ATP et les États sont mis en commun, digérés et analysés par nano-LC-MS/MS. Dans le cas par exemple montré ici la fraction 15 N-marquée a été appauvri de l'ATP. Peptides Par conséquent, le rapport des intensités de lourdes marquées (couleurs foncées) à la lumière étiquetés (couleurs claires) de la protéine de contrôle(CF1β), la protéine cible (hsp70B) et non spécifiquement liés contaminants devrait être autour de soi, alors que ce ratio devrait être très élevé pour les protéines qui interagissent spécifiquement avec la protéine cible (CGE1). Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Une analyse de l'entrée pour l'immunoprécipitation hsp70B. Protéine totale a été extrait à partir soluble (Sol) et la membrane enrichie (Pel) soit fractions appauvries de l'ATP (ATP-) ou complétée par l'ATP ATP et un système de régénération (+ ATP). 0,01% des extraits de protéines ont été séparées sur un 10% de SDS-polyacrylamide gel, et les niveaux de hsp70B et CGE1 protéine par rapport à CF1β contrôle du chargement ont été analysés par immunobuvardage. B Analyse des immunoprécipités. Hsp70B a été immunoprécipitée à partir de 14 N et15 N-soluble marquée et enrichie en membrane cellulaire contenant des extraits ou manquant de l'ATP. Protéines correspondant à 3,3% de la immunoprécipités ont été séparés sur un 10% de SDS-polyacrylamide gel et les niveaux de hsp70B et CGE1 par rapport à chargement CF1β témoins ont été analysés par immunobuvardage. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 3. Un spectre de masse représentative de hsp70B et CGE1 peptides anti-hsp70B de immunoprécipités mixtes effectuée sur les fractions solubles (14 N-ATP / 15 N + ATP). Intégral spectres MS de 14 N et 15 N peptides marqués, correspondant à l'ATP et + ATP états, respectivement, à partir de hsp70B et co-immunoprécipitées CGE1 sont affichés. Les deux peptides sont triplement chargée, le peptide hsp70B contient 22 atomes d'azote, l'Pept CGE1ide 19, correspondant à un déplacement de masse de 7,33 et 6,33 m / z, respectivement. spectres de masse B représentative de l'expérience réciproque (14 N + ATP / 15 N-ATP). Plein spectres MS des mêmes 14 N et 15 N étiquetés peptides, ici correspondant à l'ATP + et ATP-états, respectivement, à partir hsp70B et co-immunoprécipitées CGE1 sont affichés. Cliquez ici pour agrandir la figure .