La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

1. Recolección, almacenamiento y preparación de los líquidos de lavado broncoalveolar y suero Recoger el suero de las muestras de sangre sin tratar al permitir que la sangre coagule a 4 ° C, y el suero como almacén de alícuotas a -20 ° C antes de su uso. Los líquidos de lavado broncoalveolar (LBA) también se debe almacenar en alícuotas a -20 ° C. Nota: El almacenamiento de suero y BAL como alícuotas limita el potencial de la degradación del antígeno diana por repetidos de congelación-descongelación de las muestras durante las pruebas de repetición. Descongelar las muestras y se mezclan las muestras de suero y BAL bien y centrifugue durante 1 min a 14.000 rpm. Para las pruebas de rutina de muestras de suero humano, diluir el suero 01:01 (v / v) con medio de cultivo tisular (MTC). MTC consta de medio RPMI-1640, 10% (v / v) de suero fetal de ternera, 1% (v / v) de 200 mM de L-glutamina solución, y azida de sodio (0,02% w / v) como conservante. El medio se prepara de antemano y se puede almacenar a 4 ° C durante varios meses. Echar 100 l de la diluted suero a la LFD. Por BAL fluidos humanos, y para los fluidos de BAL de los modelos animales, se aplican 100 l de muestra pura a la LFD, sin pre-tratamiento. Para el suero de los modelos animales, diluir suero 1:2 (v / v) con tampón fosfato salino que contiene 4% (w / v) de EDTA, el calor para 3min en un baño de agua hirviendo, de centrifugación durante 5 min a 14.000 rpm, y se aplican 100 l de sobrenadante ordenada al dispositivo LFD. 2. La aplicación de suero y BAL en el dispositivo de flujo lateral Almacenar los dispositivos de flujo lateral a temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, los dispositivos son estables durante 12 meses. Retire los dispositivos de las bolsas y colocar en una superficie plana. Usando una punta de pipeta estéril, se aplican 100 l de pre-tratado muestra de suero o BAL ordenada al puerto de liberación del dispositivo. Permitir el ensayo para ejecutar durante 15 minutos a temperatura ambiente, momento en el cual los resultados de las pruebas debe ser registrada. Nota: En cuestión de segundos el líquido se hace a traES a migrar por acción capilar a lo largo de la membrana de nitrocelulosa en la ventana de observación. 3. Registrar e interpretar los resultados LFD El LFD consta de una línea de control interno (indicado por la letra C en la carcasa de plástico) y una línea de prueba (indicado por la letra T). La línea de control siempre debe aparecer independientemente de antígeno de Aspergillus en la muestra de suero o BAL. Esto demuestra que el ensayo ha funcionar correctamente. Si el antígeno de Aspergillus está presente en la muestra de suero o BAL, la línea de prueba aparecerá también dentro de 15 minutos de aplicación de la muestra. Debido a la intensidad de la línea de prueba es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra de Aspergillus, la línea de prueba puede aparecer como un positivo débil (+), una moderada positivo (+ +) o como una fuerte positivo (+ + +) . Sin embargo, cualquier línea de prueba positiva, independientemente de la intensidad, que indicaría la presencia de antígeno de Aspergillus en la muestra. En ªla ausencia del antígeno e de Aspergillus, ninguna línea de prueba aparecerá, y el resultado se registrará como negativo (-). 4. Los resultados representativos Ejemplos representativos de negativos, positivo débil, positivo moderado, y fuertes resultados positivos LFD con muestras de BAL y el suero se muestra en la Figura 1. Los resultados de las pruebas de antígeno-positivas UDF (débil y fuerte) o negativas las pruebas de LFD con BAL fluidos de la leucemia mieloide aguda (LMA) de los pacientes diagnosticados de acuerdo a la EORTC / MSG criterios de diagnóstico se muestran en la Tabla 1. Se incluyen en esta tabla son los correspondientes clínica y micológica (galactomanano y la cultura) de datos, y los resultados de una prueba de Aspergillus PCR específica desarrollada en el St. Bartholomew Hospital de 8, para cada paciente. El diagnóstico de la enfermedad se basa en los factores del huésped (neutropenia, el uso prolongado de corticoides, el tratamiento con otros reconocidos de células T immunosuppressants), criterios clínicos y la positividad de GM para BAL (en este caso definida como un valor de índice de GM> 0,8). En el 2002 EORTC / MSG directrices 10, 12 pacientes, 13 y 16 fueron diagnosticados con "posible" IA sobre la base de los factores del huésped y los criterios clínicos o de positividad de GM. De acuerdo con la versión revisada (2008) EORTC / MSG directrices 2, factores del huésped y la positividad de GM por sí solos o factores del huésped y los criterios clínicos por sí solos no indican "posible" infección micótica invasiva, a menos acompañada de la evidencia de los datos clínicos y micología, respectivamente. Paciente 6 fue diagnosticado con "probable" IA, con los dos años 2002 y 2008 debido a las directrices de los factores del huésped, las características clínicas mayores y menores y la positividad de GM. Tenga en cuenta que, si bien ni la LFD, ni los ensayos de PCR están actualmente incluidas en las directrices de EORTC / MSG, hay un fuerte acuerdo entre los dos ensayos y la prueba comercial de galactomanano que indican la presencia de antígeno de Aspergillus y el ácido nucleico en la muestra de BAL s de los pacientes 6 y 12. Los resultados adicionales de los ensayos demuestran la eficacia de los ensayos LFD y PCR en el diagnóstico de IPA se pueden encontrar en Johnson et al 8. Figura 1. Negativo (línea de control) y positivo (el control y la línea de la prueba) los resultados de las pruebas de LFD con suero y BAL. Las intensidades de las reacciones de prueba de línea son proporcionales a las concentraciones del antígeno diana en las muestras de suero y BAL. Las reacciones suelen oscilar entre débil (+) a través de moderada (+ +) a fuerte (+ + +). Independientemente de la intensidad de prueba de línea, las tres reacciones positivas de suero que indicaría la enfermedad invasiva aspergilosis pulmonar debido a la presencia de antígeno de Aspergillus que circula en el torrente sanguíneo. Reacciones positivas BAL (débil, moderada o fuerte) podría indicar la germinación de las esporas y el desarrollo de las hifas potencialmente patógeno en los pulmones. pdflinebreak "> Paciente no. Patient información Criterios clínicos 1 BAL cultura 2 GM EIA índice 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus PCR resultado Resultado LFD 6 – Los principales signos de TC (nódulo y el halo) y un menor Negativo 0,9 (positivo) Probable Probable Positiva Débil positivo (+) 12 Presunto infección por hongos anterior No mayor, menor un Candida glabrata 6,43 (muy positiva) Posible Ninguno Positiva Fuerte positivo (+ + +) 13 El estafilococo coagulasa-negativosylococcus y E. coli en sangre N mayor, dos menores Negativo 0,25 (negativo) Posible Ninguno Negativo Negativo (-) 16 Infección del tórax; 3 criterios menores incluyen nueva efusión plural infiltrarse en más Negativo 0,16 (negativo) Posible Ninguno Negativo Negativo (-) 1 Los nódulos o halos en una tomografía computarizada es sugestivo de infección por hongos 2 Candida glabrata en el líquido de BAL, se consideraría como un contaminante como lo es la levadura segundo más común aislado como parte de la flora normal humanos 9 3 Un índice de> 0,8 en la prueba de evaluación del impacto ambiental de GM de BAL es un indicador de infección por Aspergillus 4 A partir de los 2002 EORTC / MSG criterios de diagnóstico para 'posible "," probable "o" probado "la enfermedad invasiva por hongos 10 5 Basado en la versión revisada (2008) EORTC / MSG criterios para el diagnóstico de "posible", "probable" o "probado" la enfermedad invasiva por hongos 2 Tabla 1. Resultados de las pruebas LFD de muestras de BAL de pacientes con leucemia mieloide aguda con IPA probable y de control de los pacientes con LMA (sin evidencia de infección) y EORTC / MSG diagnóstico de la infección.