Detecção de aspergilose pulmonar invasiva em pacientes com doença hematológica maligna usando fluxo lateral Tecnologia

1. Recolha, Armazenamento e Preparação de soro e fluidos de lavagem broncoalveolar Recolher o soro de amostras de sangue não tratados, permitindo que o sangue coagular a 4 ° C, e soro de armazenamento, conforme alíquotas a -20 ° C antes de usar. Fluidos lavado broncoalveolar (BAL) deve também ser armazenados como alíquotas a -20 ° C. Nota: Armazenamento de soro e LBA como alíquotas limita o potencial de degradação do antigénio alvo por repetidos de congelamento-descongelamento das amostras durante a repetição do teste. As amostras descongelamento e misturar o amostras de soro e BAL completamente por vórtice e centrifugação durante 1 min a 14.000 rpm. Para os testes de rotina de amostras de soro humano, diluir a 1:01 de soro (v / v) com meio de cultura de tecidos (TCM). TCM consiste em meio RPMI-1640, 10% (v / v) de soro de vitelo fetal, 1% (v / v) de solução de L-glutamina 200mM, e azida de sódio (0,02% w / v) como conservante. O meio é preparado antecipadamente e podem ser armazenadas a 4 ° C durante vários meses. Aplicar 100 uL da diluted soro para o LFD. Para humanos fluidos BAL, e para fluidos BAL de modelos animais, aplicam-se 100 uL de amostra pura para o LFD, sem pré-tratamento. Para soro a partir de modelos animais, diluir soro 1:2 (v / v) com tampão fosfato salino contendo 4% (w / v) de EDTA, o calor para 3min num banho de água a ferver, de centrifugação durante 5 min a 14.000 rpm, e aplicar 100 ul de sobrenadante limpo para o dispositivo de LFD. 2. Aplicação de Soro e BAL para o dispositivo de fluxo lateral- Armazenar os dispositivos de fluxo lateral, à temperatura ambiente (23 ° C). A esta temperatura, os dispositivos são estáveis ​​durante 12 meses. Remova os dispositivos de suas bolsas e coloque sobre uma superfície plana. Usando uma ponta de pipeta estéril, aplicar 100 uL de pré-tratado amostra de soro ou puro BAL para a porta de libertação do dispositivo. Permitir que o ensaio para executar durante 15 min à temperatura ambiente, momento em que os resultados dos testes devem ser registados. Nota: No segundo o fluido vai ser sien migrar por acção capilar ao longo da membrana de nitrocelulose na janela de observação. 3. Gravação e Interpretação dos Resultados LFD O LFD consiste de uma linha de controlo interno (indicado pela letra C na caixa de plástico) e uma linha de teste (indicado pela letra T). A linha de controlo deve aparecer sempre independentemente do antigénio Aspergillus na amostra de soro ou BAL. Isso mostra que o ensaio foi executado corretamente. Se o antigénio Aspergillus está presente na amostra de soro ou BAL, a linha de teste também aparece dentro 15min de aplicação da amostra. Devido à intensidade da linha de teste é proporcional à quantidade de Aspergillus presente antigénio na amostra, a linha de teste pode aparecer como um positivo fraco (+), um positivo moderado (+ +) ou como uma forte positivo (+ + +) . No entanto, qualquer linha de teste positivo, independentemente da intensidade, que indicam a presença de Aspergillus antigénio na amostra. Em diaausência de antigénio e Aspergillus, nenhuma linha de teste irá aparecer, eo resultado é registado como negativo (-). 4. Os resultados representativos Os exemplos representativos de negativas, fracamente positivo, moderada positivos, e forte positivos LFD com amostras de BAL e soro são mostrados na Figura 1. Resultados de testes positivos de antígeno-LFD (fraca e forte) ou negativo testes LFD utilizando fluidos de BAL de leucemia mielóide aguda (LMA) dos pacientes diagnosticados de acordo com critérios da EORTC / MSG de diagnóstico são mostrados na Tabela 1. Incluem-se nesta tabela são os correspondentes clínicos e micológicos (galactomanano e cultura) de dados e resultados de um teste de PCR Aspergillus específico desenvolvido no Hospital St. Bartholomews 8, para cada paciente. O diagnóstico da doença foi baseada em fatores do hospedeiro (neutropenia, uso prolongado de corticosteróides, o tratamento com outros reconhecidos de células T immunosuppressants), os critérios clínicos e GM positividade para BAL (aqui definida como um índice GM> 0,8 valor). Sob os 2002 EORTC / MSG 10 diretrizes, os pacientes 12, 13 e 16 foram diagnosticados com IA "possível" com base em fatores do hospedeiro e os critérios clínicos ou positividade GM. De acordo com a revista (2008) EORTC / MSG diretrizes 2, fatores do hospedeiro e positividade GM isoladamente ou fatores do hospedeiro e os critérios clínicos si só, não indicam "possível" infecção fúngica invasiva, a menos que acompanhado de prova a partir de dados clínicos e micológicos, respectivamente. Paciente 6 foi diagnosticada com IA "provável" em ambos os 2002 e 2008, porque as orientações de fatores do hospedeiro, maiores e menores características clínicas e positividade GM. Note, que, embora nem o LFD nem PCR estão incluídas nas diretrizes do EORTC / MSG, há um consenso forte entre os dois ensaios eo teste de galactomanano comercial indicando a presença de Aspergillus antígeno e ácido nucléico na amostra BAL s de pacientes 6 e 12. Resultados adicionais de ensaios que demonstram a eficácia dos ensaios LFD e PCR no diagnóstico IPA podem ser encontrados em Johnson et al 8. Figura 1. Negativo (linha de controlo apenas) e positivo (de controlo e da linha de teste) os resultados dos testes LFD usando soro e BAL. As intensidades das reacções da linha de teste são proporcionais às concentrações do antigénio alvo nas amostras de soro e BAL. Reacções tipicamente variar de fraco (+) através moderada (+ +) a forte (+ + +). Independentemente da intensidade da linha de teste, todos os três séricos reacções positivas indicaria doença aspergilose invasiva pulmonar devido à presença de circulação de antigénio Aspergillus na corrente sanguínea. Positivos reacções BAL (fraco, moderado ou forte) indicaria a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas potencialmente patogénicos nos pulmões. pdflinebreak "> Nenhum paciente. Patiinformações ent Os critérios clínicos 1 LBA cultura 2 GM EIA índice 3 EORTC / MSG (2002) 4 EORTC / MSG (2008) 5 Aspergillus resultado da PCR Resultado LFD 6 – Principais sinais de TC (nódulo e halo) e um menor Negativo 0,9 (positivo) Provável Provável Positivo Fracamente positivo (+) 12 Presume infecção fúngica anterior Não maior, uma menor Candida glabrata 6,43 (positivo forte) Possível Nenhum Positivo Strong positivo (+ + +) 13 Staph coagulase-negativoylococcus e E. coli no sangue Não maior, menor dois Negativo 0,25 (negativo) Possível Nenhum Negativo Negativo (-) 16 Infecção no peito 3 critérios menores, incluindo derrame plural novo infiltrado mais Negativo 0,16 (negativo) Possível Nenhum Negativo Negativo (-) 1 Nódulos ou halos em uma tomografia computadorizada é sugestivo de infecção fúngica 2 Cândida glabrata no fluido BAL seria considerado como um contaminante como é o segundo de levedura mais comum isolado como parte de flora normal humanos 9 3 Um índice de> 0,8 no teste de EIA GM do LBA é indicativo de infecção por Aspergillus 4 Com base nas 2002 EORTC / MSG critérios diagnósticos para 'pose ',' provável 'ou' comprovada 'doença fúngica 10 5 Com base na revista (2008) EORTC / MSG critérios diagnósticos para 'possível', 'provável' ou 'comprovada' doença fúngica 2 Tabela 1. Resultados dos testes de LFD de amostras de LBA de pacientes com leucemia mielóide aguda com provável IPA e controle de pacientes com LMA (sem evidência de infecção), e EORTC / MSG diagnóstico de infecção.